鐵皮石斛內生真菌研究進展△

方香香，張壽文

(江西中醫藥大學，江西 南昌 330004)

綜 述

2014年江西中醫藥大學校級研究生創新專項資金項目：鐵皮石斛內生真菌共生培養體系研究(JZYC14B08)

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張壽文，教授，研究方向：中藥資源與開發；Tel：(0791)87118994，E-mail：hero220@163.com

鐵皮石斛內生真菌研究進展△

方香香，張壽文*

(江西中醫藥大學，江西 南昌 330004)

研究表明植物內生真菌與植物之間形成互利共生的關系，具有促進植物生長次生代謝產物積累等功能。本文簡要綜述了近年來鐵皮石斛內生真菌的分離、多樣性、促生作用、誘導子效應及生物活性等方面的進展，為今后的相關研究提供參考。

鐵皮石斛；內生真菌；多樣性；促生作用；生物活性

鐵皮石斛Dendrobiumofficinale是蘭科Orchidaceae石斛屬多年生草本植物，具有生津養胃，滋陰清熱，潤肺益腎，明目強身等功效，《道藏》中將鐵皮石斛列為“中華九大仙草”之首。現代藥理研究發現鐵皮石斛能增強免疫力、抗衰老、抗腫瘤、降血糖、降血壓等功效[1]。由于其極高的藥用價值，鐵皮石斛野生資源被大量采挖，加上其特殊的生長環境，鐵皮石斛的野生資源正瀕臨滅絕。有益微生物與植物組織外植體共同培養，植株的發育與代謝會發生變化，且植株對生物與非生物脅迫的抵抗力也會提高[2]。研究發現鐵皮石斛內生真菌對鐵皮石斛種子萌發及其生長有顯著地促進作用，并且還能提高次生代謝產物含量。本文對近十幾年關于鐵皮石斛內生真菌的分離、多樣性、對植株生長的影響及生物活性等方面進行綜述，并對鐵皮石斛內生真菌研究前景進行了展望。

1 內生真菌的分離

在植物內生真菌的分離過程中，除了盡可能保持組織的新鮮外，外植體表面的殺菌和分離培養條件是兩個關鍵因素。殺菌強度太大，不僅將表面微生物殺死，殺菌劑還可進入材料內部，殺死分布于表皮下的內生真菌，使所分離的內生真菌的種類和數量受到影響；殺菌強度過低，又會使表面真菌混于內生真菌中，造成分離失敗[3]，因此選擇合適的殺菌劑和殺菌時間非常重要。鐵皮石斛分離內生真菌組織材料表面消毒有采用乙醇與升汞的組合，吳鳳慧[4]研究結果顯示用75%酒精處理30 s后再用0.1%的升汞溶液處理3 min鐵皮石斛，根段消毒徹底且分離菌株最多；也有采用乙醇與次氯酸鈉的組合，如75%酒精處理30 s再用3%次氯酸鈉消毒4 min[5]。

分離所用的培養基對真菌的種類和數量也有影響，生長緩慢和不能在人工培養基上生長的真菌很難分離出來，因此有必要采取多種培養基來進行內生真菌的分離。如用察氏培養基分離美花石斛內生真菌，分離菌株比PDA培養基和麥麩糖培養基分離多，而PDA培養基和麥麩糖培養基分離出的菌株一樣[6]。鐵皮石斛內生真菌的分離在培養基選擇上大多采用PDA培養基。PDA和FIM兩種培養基分離鐵皮石斛內生真菌，所得的菌株不一樣，可能是因為PDA和FIM所含的成分不同，真菌對營養的偏好有所差異，而使得分離結果有所不同[4]。

2 內生真菌的多樣性

鐵皮石斛內生真菌種類、數量和分布存在較大的多樣性，主要屬擔子菌門、半知菌門[7]和子囊菌門[8]中幾十個屬。胡克興和陳玉棟等[8-9]從鐵皮石斛不同組織中分離內生真菌，發現根、莖、葉中均存在內生真菌，但是菌株種類、數量以及分布情況有所不同，其中根和莖部位的內生真菌種類和數量較葉多，鐮刀菌屬是優勢種群。

內生真菌的多樣性也存在于不同生長環境間。毛益婷等[10]將兩個處于生長期但不同生境中的鐵皮石斛營養根內生真菌進行Simpson多樣性指數分析，顯示雅長(0.984)地區鐵皮石斛內生真菌多樣性指數高于良山(O.965)，由于兩個地方鐵皮石斛的生長環境不同，內生真菌表現出不同的多樣性。

張麗[11]從鐵皮石斛栽培苗中分離出內生真菌但無菌苗中沒有分離出，并且栽培苗中內生真菌種類和數量隨生長年限的增長而呈現增多趨勢。曹斌等[12]通過對營養根組織解剖和顯微觀察，發現只有當小苗接觸栽培基質才能觀察到菌絲。表明鐵皮石斛內生真菌不是從一開始就存在于植株內，而是通過生長環境中的栽培基質進入植物組織內才形成的。由此可見生長年限和栽培基質也是鐵皮石斛內生真菌多樣性的原因。

3 內生真菌對鐵皮石斛生長的影響

3.1 內生真菌與植株共生培養

內生真菌與鐵皮石斛組培苗共生，不論是地上部分植株還是地下部分根系生長內生真菌都有較強的促進作用，增加植株高度促進長出新芽和新根[13]。接菌苗與對照組相比，平均鮮重增長率、大量和微量元素含量都有所增加[14-15]，葉綠素含量和N、K、P含量均比對照組高，內源激素GA3(赤霉素)和IAA(吲哚乙酸)含量增加ABA(脫落酸)含量降低[16-17]。內生真菌作為菌肥還能提高鐵皮石斛的存活率，顯著促進植株生長[18]。此外，鐵皮石斛內生真菌與原球莖和種子共生對原球莖的生長和種子的萌發也有促進作用。高微微等[19]采用唇蘭小菇、石斛小菇、蘭小菇與組培苗進行共生培養，發現三種內生真菌均能促進鐵皮石斛苗生長，接種了石斛小菇和蘭小菇的鐵皮石斛原球莖增殖較明顯。吳慧鳳[4]共生培養結果顯示有四種菌株均不同程度地促進了鐵皮石斛種子的萌發，菌株C22能極顯著的促進作用原球莖的鮮重增長率。鐵皮石斛內生真菌還能促進鐵皮石斛次生代謝產物的積累，增加多糖含量[20]。

雖然蘭科植物在自然條件下只有與內生真菌共生才能正常生長，但是并非所有的內生真菌對植物都是有利的，有的是致病菌，與植物共生使植物不能正常生長甚至死亡，有的則對植物生長沒有任何影響，既不抑制也不促進[21]。

3.2 真菌誘導子對植株生長的影響

真菌誘導子是來源于真菌的一種特定化學信號，在植物與真菌的相互作用中，能引起植物細胞合成積累次生代謝物，對植物具有專一性[22]。它主要是真菌的細胞表面結構或分泌物，可以是真菌菌絲體、滅活菌絲體、發酵液和分泌物等。鐵皮石斛真菌誘導子的研究表明，真菌誘導子能促進鐵皮石斛生長[23]，并且受誘導子加入時間的影響表現出不同的作用，陳曉梅等[24]發現在培養后期加入真菌誘導子多原球莖生長有促進作用，在培養前期加入則對原球莖生長有抑制作用。真菌誘導子還對鐵皮石斛的化學成分有一定的影響。宋經元[25]、楊慧[26]和陳曉梅等[27]研究表明真菌誘導子能促進次生代謝產物多糖和生物堿的積累，且誘導子制備方法、加入量、加入時期以及培養時間都會影響次生代謝產物的積累量[28]。另外陳曉梅等[29]HPLC-MS指紋圖譜分析發現真菌誘導子并沒有改變鐵皮石斛原球莖中的化學成分，但是能提高化學含量，而侯丕勇[30]采用薄層色譜和HPLC方法，結果顯示加入真菌誘導子后鐵皮石斛原球莖產生了7種新的化合物，其中3種是野生鐵皮石斛所特有的。

4 生物活性

研究發現鐵皮石斛內生真菌對鐵皮石斛黑斑病菌AF-02和AF-04有抗菌活性，通過對6種病原微生物的抑菌試驗，結果顯示其中的10株內生真菌對至少1種指示菌具有抑菌活性[31]。從鐵皮石斛中分離出的石斛小菇的發酵液對小鼠中樞神經系統有興奮作用，菌絲體和發酵液的粗提物能產生與中藥石斛相似的鎮痛作用[32]。此外，鐵皮石斛內生真菌發酵產物對HBsAg(乙肝表面抗原)[11]、HIV-1(人類免疫缺陷病毒-1)[33]也有一定的抑制作用。

5 問題與展望

目前，鐵皮石斛內生真菌的研究主要集中在內生真菌的分離、促生內生真菌的篩選及誘導子作用這幾個方面，雖然已經能夠分離出能有促進作用的內生真菌，但是將內生真菌運用到鐵皮石斛的規范化生產中還需要進一步的研究，例如鐵皮石斛內生真菌與組培苗共生培養的適宜條件，共生培養對鐵皮石斛質量的影響，菌劑的開發等等。另外，目前研究的主要對象還是鐵皮石斛植株，對內生真菌本身的研究很少。許多報道表明內生真菌能產生與宿主相同或相似的生理活性，例如從紅豆杉的樹皮中分離出的內生真菌能產生紫杉醇[34],桃兒七的莖韌皮部分離出一株能產生鬼臼毒素的內生真菌[35]。微生物作為可再生利用資源，繁殖速度快且易保存，如果能從鐵皮石斛中分離出產生與宿主相同或相似作用的內生真菌，再通過人工發酵的方法產生次生代謝產物，這將為緩解鐵皮石斛資源短缺提供新的可能。

自然界中植物體內存在多種微生物，這些微生物在植物生長的過程中分別擔任著不同的角色來促進植物種子萌發并長成健壯的植株，所以單單只研究某一種微生物對植株的影響是不全面的。此外，植物體內與之共生的微生物除了真菌以外還有細菌，有研究發現內生細菌也能促進鐵皮石斛組培苗顯著生長[5]，因此內生細菌的促生效應也具有研究價值和意義。

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AdvancesinResearchofEntophytesfromDendrobiumofficinale

FANGXiangxiang,ZHANGShouwen*

(JiangxiUnivercityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China)

Many studies have shown that endophytes forming a symbiotic relationship with plants could promote growth of plants and accumulation of secondary metabolites.The separation,diversity,growth-proving,inducer effects and biological activities of entophytes were reviewed in this article,which will provide reference for further study.

Dendrobiumofficinale;Endophytes;Diversity;Growth-promoting effect;Biological activities

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.05.020

2013-12-24)