高三酰甘油血癥合并AMI患者APOA5基因甲基化對APOA5表達水平的影響

余長風，杜 瓊

(1.仁壽縣人民醫院，四川 仁壽620500；2.四川省人民醫院，四川 成都610072)

心肌梗死(acute myocardial infarction AMI)是常見的心血管疾病，嚴重的威脅人類的生命安全[1]。臨床發現以動脈粥樣硬化為基礎的不穩定斑塊破裂是導致AMI的主要原因，而高三酰甘油血癥又是動脈粥樣硬化的重要危險因素[2]。研究發現高三酰甘油血癥和動脈粥樣硬化與遺傳因素有關，其中DNA甲基化異常是導致動脈粥樣硬化發生重要的遺傳因素之一[3]。載脂蛋白A5(APOA5)是目前已知的基因過度表達可以降低三酰甘油水平的一種載脂蛋白，但是APOA5-DNA甲基化對其APOA5表達水平的影響比較鮮見。本課題觀察高三酰甘油血癥合并AMI患者APOA5-DNA甲基化對APOA5-mRNA和APOA5蛋白表達水平的影響，旨在為AMI的早期診斷和干預提供一定的幫助，報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2013年3月-2013年5月在我院收治的高三酰甘油血癥合并急性心肌梗死男性患者20例作為觀察組，選取同期在我院體檢的高三酰甘油血癥合并頸動脈粥樣硬化男性患者20例作為對照組。觀察組：年齡(46.63±4.38)歲，體質指數(BMI)：(21.03±0.74)kg/m2。對照組：年齡(45.72±4.53)歲，體質指數(BMI)：(21.45±0.81)kg/m2。納入標準：(1)年齡30-55歲；(2)高三酰甘油血癥診斷符合《診斷學》相關診斷標準；(3)AMI診斷符合《內科學》中相關診斷標準；(4)頸動脈粥樣硬化診斷參照美國超聲放射學會制定的診斷標準；(5)入選前2周內未曾服用調脂藥物；(6)自愿加入本研究者。排除標準：(1)肥胖和其他代謝性疾病患者；(2)合并高血壓、腦卒中、糖尿病及肝腎功能不全者。兩組患者在年齡、BMI等基線特征方面比較差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究獲得本院醫學倫理委員會批準，所有納入對象均簽訂知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標本采集和處理 采集所有患者空腹靜脈血2 ml，抗凝，靜置1 h，高速離心取血漿200 μl，置于-80℃冰箱保存，用于檢測APOA5水平。剩余的血液用于DNA和RNA提取。

1.2.2 DNA和RNA提取 采用酚-氯仿抽提法提純血液標本中的DNA；采用人外周血淋巴細胞分離液(北京博邁斯生物科技有限公司)分離淋巴細胞后再采用Trizol試劑(上海華藍化學科技有限公司)提純血液標本中的RNA。采用Nanodrop-ND3300 核酸蛋白分析儀(上海智巖科學儀器公司)分別測定血液標本中DNA和RNA的濃度。

1.2.3 DNA甲基化分析 選擇觀察組和對照組各5例患者，采用illumina人類全基因組DNA甲基化研究芯片Methylation-450K(北京怡美通德科技發展有限公司)分別檢測兩組標本中DNA甲基化的差異；采用生物信息學方法分析并比較兩組患者APOA5-DNA甲基化的差異，記錄兩組DNA甲基化的差異值，以差異值>0代表高甲基化，以差異值<0代表低甲基化；差異值的絕對值越大代表差異越大。

1.2.4 APOA5-mRNA表達水平 采用實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應法(RT-PCR)檢測兩組患者全血RNA中mRNA。按試劑盒說明書操作。

1.2.5 APOA5蛋白表達水平 采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血漿中APOA5蛋白表達水平。按照人APOA5檢測ELISA試劑盒(上海博湖生物科技有限公司)說明書檢測兩組患者血漿中APOA5蛋白表達水平。

1.3 統計方法

采用SPSS16.0版統計學軟件進行處理。計量資料均采用均數加減標準差表示，組件比較檢驗分析采用t檢驗；以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組APOA5-DNA甲基化差異

兩組差異甲基化位點共有6026個(分布于2721個基因中)，其中位于CpG島的位點有3173個，不位于CpG島的位點有2853個；與對照組比較，觀察組DNA高甲基化的位點總共有4410個，其中位于CpG島的位點有2398個，不位于CpG島的位點有2012個；與對照組相比，觀察組DNA低甲基化的位點共有1616個，其中位于CpG島的位點有748個，不位于CpG島的位點有868個。共涉及信號通路178個。其中APOA5-DNA表現為高甲基化狀態，差異值為52.0384。

2.2 兩組的APOA5-mRNA表達水平比較

RT-PCR結果顯示：觀察組和對照組的APOA5-mRNA表達水平分別為[(0.036±0.015)vs(1.002±0.089)],觀察組明顯低于對照組，差異具有統計學意義(t=2.303，P<0.05)。

2.3 兩組APOA5蛋白表達水平比較

ELISA結果顯示，觀察組和對照組的APOA5蛋白表達水平分別為[(153.52±17.39) μg/L vs (198.26±23.44) μg/L],觀察組明顯低于對照組，差異具有統計學意義(t=2.449，P<0.05)。

3 討論

高三酰甘油血癥是動脈粥樣硬化和冠心病等心血管疾病重要的危險因素之一[4]。有研究表明，TG水平超過2.26 mmol/L者發生急性心肌梗死(AMI)的風險要比TG水平小于2.26 mmol/L者高50%左右[5]。APOA5是載脂蛋白基因家族成員之一，已發現其在調節甘油三酯方面具有重要的作用[6]。APOA5由肝臟合成分泌，主要分布與高密度脂蛋白、極低密度脂蛋白和乳糜微粒中,為目前發現的第一個能夠降低血漿甘油三酯水平的載脂蛋白[7]。有研究發現，高三酰甘油血癥合并冠心病患者的血清APOA5水平與血清甘油三脂水平呈負相關，因此推斷血清APOA5水平可能是冠心病等心血管疾病的影響因素[8]。

表觀遺傳學(epigenetics)是遺傳-環境-疾病的關系紐帶，是指不涉及DNA 序列改變的基因或者蛋白表達的變化，并可以在發育和細胞增殖過程中穩定傳遞的遺傳學分支學科，主要包括DNA甲基化，組蛋白共價修飾，染色質重塑，基因沉默和RNA編輯等調控機制[9]。

DNA甲基化是指在DNA甲基化轉移酶的作用下，在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共價鍵結合一個甲基基團，導致DNA結合蛋白和DNA主螺旋溝之間的結合能力下降，導致遺傳信息沉默，最終會導致生物學功能改變[10]。

近年來，由美國Illumina公司研發的人類全基因組DNA甲基化研究芯片，成為DNA甲基化研究的廣泛選擇對象，其集全面、高通量和價格低廉等優點為一體，一次可以檢測450k個甲基化位點，能覆蓋大約96%的CpG島[11]。研究發現人類全基因組DNA甲基化研究芯片與傳統的亞硫酸氫鹽修飾后測序法在DNA甲基化檢測方面具有較強的一致性，但亞硫酸氫鹽修飾后測序法需要大量的克隆測序，程序繁瑣并且價格昂貴[12]。因此，本研究采用人類全基因組DNA甲基化研究芯片進行DNA甲基化的檢測。

目前，關于高三酰甘油血癥合并AMI患者的APOA5表達與其DNA甲基化之間的關系的報道尚比較少見。本研究選擇30-55歲的男性高三酰甘油血癥合并AMI患者進行研究，排除了性別和激素水平對DNA甲基化的影響。結果顯示，與對照組中高三酰甘油血癥合并頸動脈粥樣硬化患者相比，觀察組中高三酰甘油血癥合并AMI患者表現為APOA5-DNA高甲基化。同時，進行了RT-PCR和ELISA檢測，結果顯示，觀察組中高三酰甘油血癥合并AMI患者的APOA5-mRNA表達水平和APOA5蛋白表達水平均明顯低于對照組中高三酰甘油血癥合并頸動脈粥樣硬化患者，表明APOA5-DNA高甲基化表現為APOA5-mRNA和APOA5蛋白水平的低表達。

綜上所述，高三酰甘油血癥合并AMI患者APOA5-mRNA和APOA5蛋白水平降低均與APOA5-DNA甲基化水平增高有關，APOA5-DNA甲基化異常可能參與了高三酰甘油血癥患者動脈粥樣硬化的進展。本研究納入樣本數量較小，為獲得更加真實可靠的數據，尚待擴大樣本數量進一步深入研究。

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