精子DNA損傷及其檢測

孫海龍 綜述 陳秀娟 審校

內蒙古醫科大學附屬醫院婦產科生殖中心 （呼和浩特 010059）

精子DNA損傷及其檢測

孫海龍 綜述 陳秀娟 審校

內蒙古醫科大學附屬醫院婦產科生殖中心 （呼和浩特 010059）

隨著輔助生殖技術的發展，精液常規分析已不能全面評估男性生育能力。研究表明，精子DNA損傷是男性不育、復發性自然流產(RSA)以及輔助生殖技術治療失敗的重要原因之一[1]。

一、精子結構特點

精子作為一種終末分化細胞，成熟精子攜帶由基因和環境共同決定的遺傳信息，直接影響下一代生命的形成與存在狀態。精子發育過程中發生一系列的形態變化、胞內重要結構的重排以及代謝途徑和方式的改變等，這些變化都是精子為適應環境而進行的自身調整。精子細胞核約占精子頭部的65%，是精子最重要的細胞器，由DNA和魚精蛋白（protamine，PRM）組成。在精子發生過程中，生精細胞核內與DNA結合的蛋白，經歷組蛋白到過渡蛋白再到魚精蛋白的組型轉換。單倍體圓形精子細胞剛形成時，染色質仍呈核小體結構，過渡蛋白（Transition proteins, TPs）開始出現,并逐漸取代染色體中的組蛋白, 直至替換掉90%以上的組蛋白，隨后魚精蛋白開始出現并逐漸取代過渡蛋白,最終將精子核包裝成高度濃縮的特異結構，從而保護精子免受外界因素損傷。

二、精子DNA損傷機制

（一）氧化應激

氧化應激是指機體在遭受各種有害刺激時，體內高活性分子如活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）和活性氮自由基（reactive nitrogen species，RNS）產生過多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系統和抗氧化系統失衡，從而導致組織損傷。

生理情況下，少量ROS存在，是精子發揮正常功能如獲能、頂體反應，以及精卵融合所必須的。精子質膜中含有高濃度的不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids, PURA），只含有低濃度的ROS清除酶。精子細胞內的自身抗氧化系統極其有限，且細胞內的抗氧化酶并不能保護精子頂體和尾部的質膜，這就迫使精子必須依靠精漿中的抗氧化系統。精漿抗氧化系統（total antioxidant capacity，TAC），分為兩類，一類為酶抗氧化系統，包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）等；另一類為非酶抗氧化系統，包括維生素、微量元素等[2]。精液中的ROS和精漿抗氧化能力保持平衡，當精液中的ROS增加或精漿抗氧化能力減低時，這種平衡被打破，從而導致氧化應激的發生[3]。超氧化物可使精子在氧化應激的作用下發生脂類過氧化反應，使精子膜的流動性和完整性受損，精子DNA更易暴露于外界環境中而受到損傷[4]。

（二）凋亡異常

細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，是指細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序結束生命的過程。凋亡是精子發生過程中的一個重要環節，自發凋亡對維持正常精子數量及精子質量非常重要[5]。有證據提示，許多質量不好的精液中缺乏精子正常凋亡。生精細胞凋亡通過Fas/FasL及半胱氨酰天冬氨酸酶（Caspase）途徑介導，該途徑異常可導致DNA損傷的生精細胞逃脫正常的程序化死亡，不斷增殖分化，導致DNA損傷精子數量增加[6]。如果一個DNA受損的精子不從機體中消除，就有可能與卵子結合、受精，導致流產或胎兒出生缺陷的發生。

生精細胞過度凋亡可導致精細胞減少（精子減少），這可能是導致男性不育的重要原因之一，在自然狀態下，環境因素如激素、溫度、化學藥物、射線以及腫瘤等均可誘導生精細胞凋亡。

（三）精子核成熟過程異常

精子細胞核成熟過程中需要發生組蛋白向魚精蛋白（PRM1和PRM2）的轉變[7]。組蛋白被魚精蛋白取代過程中常伴隨生理性的DNA雙鏈斷裂，這些斷裂如果不能及時有效修復便會引發DNA損傷[8]；魚精蛋白與DNA結合后，魚精蛋白分子內和分子間的巰基逐漸被氧化成二硫鍵，使精子DNA與魚精蛋白結合更為緊密，精子核更趨濃集和穩定[9]。Prm1和Prm2在精子中恒定于0.8～1.2這一嚴格比例標準[10]，當魚精蛋白合成缺陷或功能異常時，必然會導致精子染色質濃縮過程的異常，形成松散結構的染色質，引起精子DNA損傷。

三、精子DNA損傷原因

（一）微量元素缺乏

微量元素是精液的重要生化成分，對維持精子生存環境的穩定有重要的生物學意義，微量元素直接參與精子的構成，對精子的成熟、運動、獲能及頂體反應等一系列生理功能產生影響。

鋅（Zine，Zn）是二價的陽離子，能和許多陰離子結合，而且對電子親和力特別高，所以鋅能與許多基團和配體相結合。與鋅結合的基團或配體所生成的絡合物比較穩定。人體內鋅的含量以精子中為最高，其次是前列腺、指甲和骨骼。鋅能夠延緩精子細胞膜的脂質過氧化，維持細胞膜結構的通透性和穩定性[11]，從而使精子保持良好的活力。硒作為體內抗氧化劑，參與消除體內產生的各種自由基，研究表明精漿中的硒能使人類精子細胞免受氧化性DNA損傷[12]。此外，精液中的鎘能置換DNA鋅指結構中的鋅離子，導致DNA的修復受到抑制，同時也能誘導細胞膜結構上的過氧化導致精子DNA氧化損傷。

（二）生殖系統疾病

生殖道感染和非特異性炎癥增加了精子DNA損傷，可能由于生殖道感染和非特異性炎癥使精液中白細胞的數量增加，引起局部氧自由基增加，導致氧化應激，并最終損傷精子DNA[13]。生殖道人乳頭瘤病毒（HPV）感染時HPV DNA可以非特異性、多位點方式整合入人精子染色體中，增加了精子基因的不穩定性，誘導精子染色體畸變，其結果必然造成精子DNA損傷[14]。

精索靜脈曲張（varicocele ,VC）是引起男性不育的重要原因，黃宇烽[15]報道了VC導致不育的細胞分子機制，與生精細胞凋亡異常和睪丸組織、精漿中過量ROS導致精子DNA損傷有關。Zini等[16]研究顯示，VC患者術后4個月的精子DNA碎片率較術前顯著降低。

（三）溫度異常

精子發生需要適宜的溫度，哺乳動物陰囊溫度一般比腹腔溫度低2～8℃，適于精子的生成。精子的發生過程對溫度非常敏感。研究發現，陰囊溫度增高可導致精液質量和精子DNA完整性均下降[17]。其原因可能是：作用在睪丸和附睪的熱應激導致冷誘導RNA結合蛋白（cold inducible RNA-binding protein，CIRP）表達減少，而使生殖細胞凋亡數量增多，造成生精能力喪失，也可能是組蛋白與魚精蛋白的比率增加使精子DNA結構發生改變，導致精子DNA損傷。近期研究顯示溫度越高對精子染色質的破壞越大[18]。

（四）吸煙

關于吸煙對精子DNA的影響，國內外學者已進行了大量的研究。已有的研究結果發現，香煙煙霧中含有大量自由基，如H2O2、O2-，它們可使DNA發生氧化和過氧化損傷，導致DNA鏈斷裂[19]；吸煙還會增加DNA的脆弱性。煙草中的尼古丁及其代謝產物中富含有誘導基因突變和致癌的物質，這些物質可使精子對酸性誘變劑的敏感性增高，導致精子DNA鏈斷裂增加。

（五）環境污染物

環境因素與精子DNA完整性間存在一定關系。Rubes等[20]究發現，暴露于污染環境中的人, 精子DNA損傷率有顯著增高。苯及其同系物甲苯、二甲苯與人們的生活密切相關，它們被廣泛的應用于油漆、噴漆、印刷、橡膠、制鞋、五金機械及有關化工合成等許多方面，苯及其同系物作為脂溶性化合物，容易通過血-睪屏障進入睪丸。睪丸上皮細胞富含代謝酶類[21]，在這些酶的作用下，苯可產生ROS，從而誘發精子DNA氧化性損傷。

（六）射線及化療藥物

人們對電離輻射損傷的認識已有幾百年的歷史，電離輻射通過直接和間接效應對精子DNA造成損害。直接效應是指DNA直接吸收射線能量而遭損傷；間接效應是指DNA周圍其他分子吸收射線能量產生具有很高反應活性的自由基進而損傷DNA[22]。近期有報道無線網絡（WiFi）對精子的活力和精子染色質完整性都有影響[23]。癌癥的化學療法和放射療法對DNA的損傷更是廣為人知，許多腫瘤治療藥物都是以DNA作為靶點, 抗癌藥物的使用會造成精子染色質的損傷，并且動物實驗證實這些 藥物不僅會引起DNA的斷裂，還會引起精子DNA甲基化等表觀遺傳的變化[24]，因此對于尚未生育的癌癥患者在治療前建議進行精子凍存，以備后用。

（七）年齡

精子DNA完整性與年齡因素密切相關。Wyrobek等[25]，通過對20～80歲人群進行精子DNA完整性檢測發現，年齡是影響精子DNA完整性的重要因素，隨年齡增加，凋亡精子百分率增加，DNA完整精子百分率降低。

（八）輔助生殖技術

體外精液處理技術是輔助生殖技術中的常規操作，其目的是獲得沒有精漿、細胞碎片及病原微生物的精子懸液，得到足夠數量形態及功能正常的精子。目前臨床上常用的方法有上游法、密度梯度離心法和離心洗滌法。但很少有人知道這些處理技術對精子DNA完整性的影響。用上游法處理后變性DNA精子的百分數與未處理精液相比明顯減少。與未處理精子相比，用2層和4層Percoll梯度離心處理后平均精子活力在相當大程度得到改善，但是變性DNA精子百分數增加。有文獻報道冷凍過程中產生的活性氧，可導致精子DNA損傷[26]，凍存時間對于精子DNA完整性有影響，不添加保護劑直接凍存和添加保護劑對精子DNA完整性的影響無顯著差異，只有在經過一次上游法處理后染色質質量才會得到改善。此外，體外處理時間過長、離心步驟過多和離心速度過快，均會造成精子的物理損傷并形成過氧化物或其他殘留物，ROS也會大量增加，造成精子DNA氧化損傷。

近年來，微流控芯片精子分選法已應用于臨床，微流控芯片精子分選技術是利用流體在納米尺寸管中形成層流，以及各層液體之間互不干擾的物理現象來設計芯片，利用精子活動性的自然特性，精子運動速度大于一定值的精子從原液中通過層流面游到另一個液流中，從而實現對活動精子的分選[27]。王維等[28]研究發現，微流控芯片法和傳統上游法所優選出來的精子相比較，芯片法更能優選出低DNA損傷率的精子。

這些研究結果提示我們要重新看待輔助生殖技術中精液的處理方法，選擇最佳的組合方式。

四、精子DNA完整性的檢測方法

（一）精子染色質結構分析試驗（SCSA）

SCSA的方法與原理是：染色質結構損傷精子的魚精蛋白S-H沒被氧化，形成松散結構的染色質，DNA在酸的作用下變性成單鏈。吖啶橙（AO）可與雙鏈DNA結合呈單體形式發出綠色熒光，與單鏈DNA結合呈聚合物形式發出紅或黃色熒光。然后通過配有專用軟件的流式細胞儀可進行數據處理得出SCSA參數[29]。SCSA的創始人Evenson，對SCSA參數用于男性生育力的評估和預測亞臨床不孕進行了大量研究，得出評估人生育潛能的閾值：0～15%時具有高生育潛能；16%～29%具有中生育潛能；≥30%具有低生育潛能；80%～90%無生育能力[30]。SCSA是檢測精子DNA損傷中使用較多的一種方法，被認為是檢測精子DNA損傷的“金標準”[31]。

（二）熒光原位雜交技術（FISH）

FISH是以熒光標記取代同位素標記而形成的一種新的原位雜交方法。探針首先與介導分子結合，雜交后再通過免疫化學過程連接上熒光染料，在核中或染色體上相應的DNA序列上顯示雜交信號。其最大優點是可以與間期細胞核雜交，對一些體外不能分裂的細胞如人的成熟精子尤為合適。

（三）彗星實驗

基本原理是：DNA損傷斷裂后，在強堿的條件下，DNA雙鏈被打開，釋放出斷裂的DNA片段，暴露了負電荷，電泳時，在電場力作用下，從核內遷出，向陽極遷移，從而形成“彗星”狀影像。DNA損傷越多，進入尾部的DNA碎片越多。結果的判斷有不同方法，可根據計數一定量細胞中彗星細胞所占的比例，估計精子DNA損傷比率；還可以在顯微鏡下或在照片上測出彗星細胞的一些長度數值，如尾長和彗星細胞總長、尾長與頭部直徑比值等，評估DNA損傷程度。但用上述指標評估精子DNA損傷程度尚不全面。有人用“尾距”來表示精子DNA損傷程度，尾距為尾部DNA占總DNA的百分率與頭、尾部中心間距的乘積。研究發現，尾距與精子DNA損傷程度可保持較好的線性關系，故該參數能較滿意地用于多種情況下的彗星試驗分析。

（四）原位末端標記法（In situ end-labeling，ISEL）

ISEL是將摻入到凋亡細胞中的外源性核苷酸在酶的催化下與細胞中斷裂的單鏈或雙鏈DNA相結合，并通過一定的顯示系統使之顯示出來。ISEL有兩種：原位缺口平移法（In situ nick translation，ISNT）和末端轉移酶介導的dUTP末端標記法（terminal deoxynu- cleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling ，TUNEL）。結果可用流式細胞儀、熒光顯微鏡或光學顯微鏡檢測。

（五）精子染色質擴散試驗（sperm chromatin dispersion test，SCD）

SCD是由Fernández等[32]，首先于2003年提出的一種檢測精子DNA損傷的新方法，基本方法和原理是：精子包含魚精蛋白，可作為精子主要的核蛋白與其他細胞進行標志性區分。運用核蛋白溶解液可以在精子細胞和其他細胞之間造成不同核蛋白的擴散速度。魚精蛋白的擴散速度比組蛋白快，可用DNA靶向性染料染色分辨精子細胞和其他細胞。精子核蛋白擴散還可用來分析包含較多染色質斷裂的精子細胞。沒有大量DNA 斷裂的正常精子細胞可形成由DNA延伸環組成的核暈，而有較多DNA斷裂的異常精子細胞沒有核暈，或者核暈很小。SCD 法正是運用核蛋白攜帶DNA擴散的原理，對精子DNA斷裂程度進行檢測。將精子懸液與瓊脂糖混合鋪于載玻片上，酸處理后溶解細胞去除核蛋白，用DAPI試劑染色，最后用熒光顯微鏡觀察。由于熒光容易發生淬滅，暈環的大小在熒光顯微鏡下不容易區分，也不容易區分精子和其他精液細胞。Fernández等[33]，改進了SCD檢測方法，用瑞氏染液染色，可在光學顯微鏡下觀察結果。根據精子DNA產生的光暈進行評估，正常的精子DNA產生擴散的光暈，而損傷的精子DNA則不產生或產生很小的光暈。

（六）8-羥基脫氧鳥苷（8-Hydroxydesoxyguanosine, 8-OHdG）測定法

8 -羥基脫氧鳥苷（8-OHdG），是精子DNA氧化損傷較理想的分子生物學標記物，是ROS攻擊DNA分子中的鳥嘌呤堿基第8位碳原子而產生的一種氧化性加合物（DNA加合物是親電性化合物及其代謝產物和生物體內的DNA形成的共價結合產物，是DNA化學損傷的最普遍形式）。ROS能直接與DNA分子反應,導致DNA鏈斷裂、堿基修飾和DNA蛋白交聯等氧化性DNA損傷，其中最主要的致突變性損傷反應是C-8上鳥嘌呤與胸腺嘧啶堿基顛換性突變，產生8-OHdG。8-OHdG在體內穩定存在，從精子中提取的DNA在變性后依次用脫氧核糖核酸酶 、核酸酶及堿性磷酸酶消化DNA,然后通過液相色譜電化學檢測器檢測8-OHdG和脫氧鳥苷（dG）濃度，結果用OHdG/ 105dG表示，8-OHdG含量與精子DNA氧化損傷程度成正相關。

（七）聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR）

目前，PCR主要用來研究精子線粒體DNA完整性。PCR技術可更精細地研究精子DNA的完整性是否異常，較為客觀可靠，可進行定量或定性研究。但PCR對樣品的保存和放置時間等影響染色質結構完整性的變化因素較為敏感。因此。嚴格控制精子放置的溫度與時間，對流式細胞精子染色質結構分析是非常重要的。

（八）激光拉曼光譜技術

精子質量評估普遍采用的是DNA核酸染料，雖然具有很高的靈敏性，但其對精子具有破壞性，因此，很難用測定后的樣本進行下一步的活體實驗驗證。近來，Mallidis等[34]，采用拉曼光譜技術來檢測精子DNA損傷。精子拉曼光譜主要是由糖、脂類、蛋白質和核酸等成分疊加而成，精子不同拉曼光譜頻率對應地反映出精子內部物質組分的變化，這有助于從分子生物學水平進一步研究精子DNA空間結構的變化。拉曼光譜具有非侵襲性和無損檢測的特點，因此，不會對活的生物樣本造成損傷，結合生物信息學分析方法，有望對其與卵母細胞受精以后的胚胎發育做出準確的判斷和預測[35]。拉曼光譜作為一種無損傷的生殖細胞評估技術，對臨床有重大的研究價值，可望成為精子形態與功能的新的無創評估技術。

五、展望

目前，精子DNA完整性在男科學和生殖醫學中的重視程度正在逐步提高，但精子DNA損傷發生的確切機制尚不完全清楚，其治療還處于探索階段。雖然目前已有多種精子DNA完整性的檢測方法，但尚缺乏一種快速、簡便、標準化且能夠廣泛普及的檢測方法。隨著對精子DNA完整性研究的逐步完善和發展，相信在不久的將來，有望研究出一種理想的檢測精子DNA完整性的方法。

精子; DNA損傷

1 Sakkas D, Manicardi GC, Bizzaro D.Adv Exp Med Biol2003; 518: 73-84

2 Lanzafame FM, La Vignera S, Vicari E,et a1. Reprod Biol Med Online2009; 19(5): 638-659

3 Omu AE, Al-Azemi MK, Kehinde EO.Med Princ Pract2008; 17(2): 108-116

4 Gharagozloo P, Aitken RJ.Hum Reprod2011; 26(7): 1628-1640

5 Hikim AP, Lue Y, Yamamoto CM,et al. Endocrinology2003; 144(7): 3167-3175

6 Marchiani S, Tamburrino L, Maoggi A.Mol Hum Reprod2007;13 (9): 621-631

7 Govin J, Caron C, Lestrat C,et al. Eur j Biochem2004; 271(17): 3459-3469

8 Leduc F, Maquennehan V, Nkoma GB.Biol Reprod2008; 78(2): 324-332

9 Ward WS.Mol Hum Reprod2010;16 (1): 30-36

10 Aoki VW, Liu L, Carrell DT.Hum Reprod2005; 20(5): 1298-1306

11 Dissanayake D, Wijesinghe P, Ratnasooriya W,et al. J Hum Reprod Sci2010; 3(3): 124 -128

12 Gaspari L, Chang SS, Santella RM,et al. Mutat Res2003; 535(2): 155-160

13 Kopa Z, Wenzel J, Papp GK,et al. Andrologia2005; 37(5): 188-194

14 Huang JM, Huang TH, Qiu HY,et al. World J Gastroenterol2003; 9(4): 736-740

15 黃宇烽. 中華男科學雜志 2010; 16(3): 195 - 200

16 Zini A, Azhar R, Baazeem A,et al. Int J Androl2011; 34(1): 14-19

17 Banks S, King SA, Irvine DS,et al. Reproduction2005; 129(3): 505-514

18 Chao SB, Guo L, Ou XH,et al. Hum Reprod2012; 27(4): 1016-1024

19 Sepaniak S, Forges T, Gerard H,et a1. Toxicology2006; 223(1-2): 54-60

20 Rubes J, Selevan SG, Evenson DP,et al. Hum Reprod2005; 20(10): 2776-2783

21 宋博, 蔡志明, 李欣, 等. 中華男科學雜志 2005; 11(1): 53-55

22 Hendricks KE, Penfold LM, Evenson DP.Theriogenology2010; 73(2): 267-272

23 Avendaf o C, Mata A, Sanchez Sarmiento CA.Fertil Steril2012; 97(1): 39-45

24 Codrington AM, Hales BF, Robaire B.Hum Reprod2007; 22(5): 1431-1442

25 Wyrobek AJ, Eskenazi B, Young S,et al. Proc Natl Acad Sci U S A2006; 103(25): 9601-9606

26 Thomson LK, Fleming SD, Aitken RJ, et al. Hum Reprod2009; 24(9): 2061-2070

27 王維, 黎維生, 彭婭婭, 等.中華檢驗醫學雜志 2009; 32(8): 920-923

28 王維, 梁廣鐵, 彭婭婭, 等. 中華男科學雜志 2011; 17(4): 301-304

29 Giwercman A, Lindstedt L, Larsson M,et a1. Int J Androl2010; 33(1): e221-e227

30 Evenson D, Jost L.Methods Cell Sci2000; 22(2-3): 169-189

31 Sergerie M, Laforest G, Boalanger K,et al. Hum Reprod2005; 20(7): 1921-1927

32 Fernández JL, Muriel L, Rivero MT,et al. J Androl2003; 24: 59-66

33 Fernández JL, Muriel L, Goyanes V.Fertil Steril2005; 84(4): 833-842

34 Mallidis C, Wistuba J, Bleisteiner B.Hum Reprod2011; 26(7): 1641- 1649

35 Seli E, Vergouw CG, Morita H,et a1. Fertil Steril2010; 94(2): 535-542

（2014-05-30收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.09.020

R 321.1