江西省檢測HIV-1新近感染的BED捕獲酶免疫實驗的室內穩定性評價

靳廷麗，唐翼龍，易志強，劉麗萍，樊寒藝

(江西省疾病預防控制中心，江西南昌330029)

江西省檢測HIV-1新近感染的BED捕獲酶免疫實驗的室內穩定性評價

靳廷麗，唐翼龍，易志強，劉麗萍，樊寒藝

(江西省疾病預防控制中心，江西南昌330029)

目的對江西省BED捕獲酶免疫檢測方法(BED capture enzyme immunoassay,BED-CEIA，簡稱BED)的實驗穩定性進行評價。方法在江西省艾滋病確證中心實驗室使用BED方法對2011-2012年新確證的艾滋病病毒抗體陽性血清進行新近感染檢測。對每次試驗的試劑質控品(陰性對照、校準品、弱陽性對照和強陽性對照)的吸光度OD值和標化OD值(OD-n)的均值(Mean)、標準差(SD)和變異系數(CV)進行分析及對實驗的初篩和確認實驗結果的一致性進行比較。結果對OD-n的統計顯示，質控品陰性對照的變異系數為37.3%。校準品、弱陽性對照和強陽性對照的變異系數在7%以內；初篩和確認實驗結果的回歸分析決定系數R2值達到了0.9以上。結論江西省艾滋病確證中心實驗室使用BED-CEIA方法較穩定，質控在控，結果可靠,但陰性對照變異系數有待于降低。

江西省；HIV-1；新近感染；BED；穩定性；評價

長期以來艾滋病病人(AIDS)、艾滋病病毒(HIV)感染者的病例報告、哨點監測、行為監測等監測方法,為發現艾滋病疫情,掌握艾滋病流行趨勢、高危行為的變化情況,以及評價干預措施的效果等提供了大量的依據。但通過上述監測方法只能獲得累積感染率，無法獲得直接準確的新近感染的數據,不能敏感地反映疫情的真正變化趨勢和干預措施的效果,美國疾病預防控制中心(CDC)組織開發BED監測方法，這種方法采用1型HIV病毒特異B、E和D亞型的gp41抗原決定序列所合成的分支肽作為抗原，檢測其抗體的一種捕獲酶免疫檢測方法，因此命名為BED-CEIA。其原理是人體感染艾滋病病毒后，體內艾滋病病毒特異IgG抗體占人體總IgG抗體的比例隨感染時間延長而逐漸上升，通過檢測血清陽轉后HIV-IgG抗體占總IgG的比例達到一定的值來判斷是否為新近感染[1]。2011年我省艾滋病確證中心實驗室獲得該檢測方法的實驗室認可。本研究是對該實驗方法在我們實驗室的室內穩定性做一評價。

1 材料與方法

1.1 實驗對象2011年至2012年全省艾滋病病毒抗體陽性血清樣品。樣品的采集、運輸、檢測及保存均嚴格按照《全國艾滋病檢測技術規范》要求執行。檢測樣本的納入標準：(1)HIV-1抗體陽性(蛋白免疫印跡試驗(WB)為陽性)；(2)血樣保存在-20℃以下，反復凍融少于3次，清亮、無嚴重溶血、無交叉污染；(3)如果同1人在3個月內出現2份或以上的確認陽性血樣，將第1份樣本納入新近感染檢測，其余樣本從樣本中剔除。排除標準：(1)已向監測系統報告的HIV感染者血樣(非初次診斷陽性者)；(2)該血樣采集時間距HIV-1抗體陽性檢測記錄時間已超過3個月；(3)接受抗病毒治療的HIV感染者血樣；(4)CD4細胞數＜200個／μl的艾滋病感染者血樣。

1.2 試劑和方法試劑盒購自美國Sedia公司，每個試劑盒均在效期內。每盒試劑提供質控品一套，包括陰性質控(NC)、校準品(CAL)、弱陽性質控(LPC)和強陽性質控(HPC)。新近感染檢測實驗分為初篩試驗和確認試驗，每個反應板中包含2個NC及各3個CAL、LPC和HPC。按照檢測試劑盒說明書對樣品進行處理。反應結束后，OD值使用450nm檢測波長、630nm參考波長測定，OD值換算成OD標化值(OD-n值)，質控品：ODn值＝質控品的中值OD值/校準品的中值OD；樣品：初篩實驗樣品ODn值＝樣品的OD/校準品的中值OD；確認實驗各樣品的ODn值＝各樣品的中值OD值/校準品的中值OD。初篩實驗為單孔檢測，OD標化值(OD-n值)＞1．2者為既往感染，OD-n值≤1．2者將進行確認試驗。確認實驗是將樣本分3孔重復檢測，OD-n值＞0．8者為既往感染，OD-n值≤0．8者為新近感染。實驗中得到質控品(NC、LPC和HPC)的OD以及其標化的OD-n必須在試劑盒規定的范圍內，該次實驗才有效；否則為無效實驗，需重復檢測。將樣品、質控品的OD值輸入EXCEL表，計算酶標板的質控品(NC、CAL、LPC和HPC)OD和OD-n的均數、標準差和變異系數(Mean、SD和CV)，計算線性回歸分析決定系數R2，比較檢測樣品初篩和確認實驗中OD-n值的一致性。

2 結果

2.1 實驗中(包括初篩和確證實驗)的OD和OD-n的Mean、SD及變異系數(CV)值的統計結果見表1。

表1 質控品OD(OD-n)的Mean，SD和CV的比較

2.2 根據BED-CEIA方法的實驗流程，初篩試驗中OD-n＜1．2的樣品需要進行BED確認試驗(3份重復檢測)。統計分析實驗中324樣品初篩試驗和確認試驗OD-n的結果，其回歸分析決定系數R2為0．9143，實驗穩定性可靠。

3 討論

樣品檢測的初篩試驗和確認試驗OD-n值一致性結果較好，其相關系數R2為0．9143，說明BED實驗可重復性好，試劑盒本身穩定，實驗結果較理想、可靠。變異系數(CV)是用于評價不同抗體滴度血清BED-CEIA測量值的離散程度(信度)。OD-n值是經過標化的OD值，OD值進行標化后測量值的集中度提高，標化是必要的。本實驗中質控品HPC和LPC的OD-n值的變異系數(6%～7%)小于OD值的變異系數(12.7%～16.8%)[2]。

本實驗陽性質控品(LPC、HPC)的OD-n值的變異系數(6%～7%)與國家參比室的報道6%左右相近，而陰性質控品(NC)的OD值變異系數達33.8%，明顯高于參比室的14.4%的值，也高于國外所報道的27．2%，這會使得使用低抗體滴度的標本檢測的信度降低[3-6]。由于NC的測量值非常低，數值的稍許改變，會導致變異系數增大，因此對實驗室人員的操作和實驗室條件要求更加嚴格，需要進一步提高檢測質量控制。在我們實驗中出現2次對照和校準品OD值低于試劑盒要求范圍，導致實驗無效，考慮為孵育溫度偏低所影響，這也說明在開展BED-CEIA檢測之前，需要對實驗室的硬件進行嚴格的現場檢查[7]。

為保證BED檢測方法的質量控制要做到：建立BED檢測的SOP文件和QA/QC計劃；酶標儀和加樣器需在校準有效期內；每次試驗必須通過質控；任何一次檢測出現無效實驗，均需進行重復檢測，一旦實驗結果發生偏倚，要仔細檢查試劑和質控品的有效期以及貯存溫度；核對洗液的配制濃度；檢查酶標儀、洗板機及加樣器的校準期；嚴格按照說明書控制孵育溫度和時間，所有上述事項核對無誤后，重新進行實驗。

通過對實驗結果的分析可以看出該方法穩定性和重復性均十分好，但還有不足之處，我們還需進一步提高檢測的精確性，做好檢測前、檢測中和檢測后的質量控制，相信BED-CEIA方法會在我省的艾滋病防治事業中會發揮重要作用。

[1]Parekh BS,Kelnnedy MS,Dobbst T,el a1.Quantitative detection of increasing HIV type l antntibodies after seroconversion:a simple assay for decetion recent HIV infection and estimating incidence [J].AIDS Res hum Retroviruses,2002，18(4)：295—307．

[2]呂繁,趙金扣,蔣巖,等.BED HIV-1發病監測方法及其應用[J]．中國艾滋病性病，2006，12(2)：179-181．

[3]王慧杰,蔣巖,韓梅,等.檢測HIV-1新近感染的BED捕獲酶免疫實驗的重復性和穩定性評價[J].中國艾滋病性病，2007，13(4)：305-307.

[4]楊錦,段松,王繼寶,等.BED捕獲酶聯免疫試驗檢測HIV新近感染者的敏感度和特異度[J].中國衛生檢驗雜志，2013,23(1):114-117.

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[7]陸勝,季雄娟.實驗室分析前質量控制淺析[J].實驗與檢驗醫學, 2012,30(1):46-47.

R512.91，R446.62

A

1674-1129(2013)03-0232-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.03.011

江西省衛生廳重大招標課題(編號：2010-2012)

靳廷麗，1978年出生，碩士，從事艾滋病實驗室檢測。