結(jié)直腸癌組織中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因多態(tài)性臨床研究

侯安繼，高紅芳，胡 艷，趙德民，茅佩娟

(1.上海市第七人民醫(yī)院腫瘤科，上海200137;2.上海市第七人民醫(yī)院外科，上海200137;3.上海市第七人民醫(yī)院心內(nèi)科，上海200137)

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)基因多態(tài)性由DD 型、ID 型和II 型等3 種基因型組成，分為D 等位基因和I 等位基因。長(zhǎng)期以來，人們認(rèn)識(shí)到血管緊張素(angiotensin，Ang)水平在個(gè)體中穩(wěn)定，在個(gè)體間或不同人種間差異顯著，近來的研究證實(shí)這種差異與ACE 基因多態(tài)性相關(guān)［1］。ACE基因多態(tài)性分布可能與結(jié)腸癌發(fā)病存在一定關(guān)系，但所得結(jié)論有待進(jìn)一步驗(yàn)證［2］。

近年來，結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)發(fā)病率持續(xù)上升，除了已知的遺傳因素外，是否與膳食結(jié)構(gòu)改變、生活方式變化等因素有關(guān)值得關(guān)注。此外，作為調(diào)控血壓和血管生成的重要基因，ACE 基因多態(tài)性與腫瘤關(guān)系的研究日益受到重視，不同研究者對(duì)多種腫瘤與ACE 基因多態(tài)性的關(guān)系進(jìn)行了研究，大多研究［3-6］認(rèn)為ACE 基因多態(tài)性與腫瘤之間存在一定的相關(guān)性，應(yīng)用ACE 抑制劑也能降低腫瘤發(fā)病率，但也有研究不支持該結(jié)論，說明ACE 基因多態(tài)性與腫瘤的關(guān)系尚未弄清;ACE 基因與CRC 的關(guān)系亦是如此，說明ACE 基因多態(tài)性與CRC 的關(guān)系值得進(jìn)行深入的基礎(chǔ)與臨床研究。

本文在研究外周血ACE 基因多態(tài)性基礎(chǔ)上，研究結(jié)直腸癌組織和癌旁組織標(biāo)本中ACE 基因多態(tài)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):1)臨床確診為CRC，接受手術(shù)治療且資料完整者;2)所有病例須取得病理學(xué)診斷;3)年齡20 ～79 歲，預(yù)計(jì)生存期在3 個(gè)月以上，PS 評(píng)分≤2 分;4)入組前4 周內(nèi)，未接受過放、化療者。排除標(biāo)準(zhǔn):1)未取得病理診斷者;2)年齡不符;3)原發(fā)性高血壓病患者;4)兩端切緣有一端陽(yáng)性者;5)不愿意接受本研究措施或隨訪不便者。

1.2 一般資料 選擇我院普外科2011年1月至2012年12月手術(shù)的CRC 患者30 例，年齡25 ～79 歲，中位年齡為61.5 歲;男17 例，女13 例;結(jié)腸癌25 例，直腸癌5 例;臨床分期:I～Ⅱ期者14 例，Ⅲ～Ⅳ期者16例。所有切除的新鮮腫瘤組織經(jīng)標(biāo)記后置于液氮罐中保存?zhèn)溆茫糠帜[瘤組織和兩端切緣進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，供病理切片診斷，結(jié)腸中分化腺癌8 例，結(jié)腸乳頭狀腺癌3 例，結(jié)腸黏膜浸潤(rùn)性腺癌3 例，結(jié)腸中低分化腺癌5 例，結(jié)腸黏液腺癌2 例，結(jié)腸管狀腺癌1 例，結(jié)腸印戒細(xì)胞癌1 例，直腸中分化腺癌5 例，直腸管狀腺癌2 例。

1.3 DNA 的提取、引物的合成及PCR 擴(kuò)增 采用蛋白酶K 消化酚- 氯仿抽提法提取DNA。ACE-I和ACE-Ⅱ引物委托上海生工合成，引物序列參考文獻(xiàn)［7］，引物1 為ACE-I，其擴(kuò)增片段大小:插入型為597 bp，缺失型為319 bp。PCR 擴(kuò)增體系總體積25 μL，反應(yīng) 體 系 包 括Taq 酶1. 0 μL，10 × buffer 2.5 μL，10 mmol·L-1，dNTP 和引物(10 pmol·μL-1)各0.5 μL，模板gDNA 約100 ng。PCR 的擴(kuò)增條件:先予94 ℃預(yù)變性5 min，然后94 ℃30 s，再56 ℃45 s，及72 ℃1 min，總共35 個(gè)循環(huán)，最后步驟為72 ℃5 min;引物2 為ACE-Ⅱ，反應(yīng)條件同ACE-I，退火溫度為65 ℃，擴(kuò)增片段大小為335 bp。對(duì)于DD 型標(biāo)本進(jìn)行再擴(kuò)增驗(yàn)證，若擴(kuò)增出目的片段則該標(biāo)本實(shí)際為ID 型。ACE-I:upper:5’-GCCCTGCAGGTGTCTGCAGCATGT-3’;down:5’-GGATGGCTCTCCCCGCCTTGTCTC-3’。ACE-Ⅱ:upper:5’-TGGGACCACAGCGCCCGCCACTAC-3’;down:5’-TCGCCAGCCCTCCCATGCCCATAA-3’。

1.4 PCR 產(chǎn)物檢測(cè) 經(jīng)前述實(shí)驗(yàn)過程所得到的PCR產(chǎn)物采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，共需30 min，所使用的Marker 為DL2000，所用電壓為100 v，電泳結(jié)束后在紫外燈下觀察條帶。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 基因亞型特點(diǎn) 經(jīng)ACE-I擴(kuò)增后，3 種亞型的特點(diǎn)為:DD 型見319 bp 片段條帶，II 型為579 bp 條帶，ID 型則可見上述2 種片段的條帶。為防止DD 型優(yōu)勢(shì)錯(cuò)配影響結(jié)果，對(duì)ACE-I擴(kuò)增后為DD 型標(biāo)本采用ACE-Ⅱ進(jìn)行驗(yàn)證，若能擴(kuò)增出335 bp 條帶則為ID 型。

2.2 ACE 基因型檢測(cè)結(jié)果 CRC 組織中II 型、ID型、DD 型分布頻率分別為16. 67%、43. 33%、40.00%，癌旁正常組織3 種基因型分布頻率分別為30.00%、53.33%、16.67%，構(gòu)成比比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.857，P ＜0.05)。

2.3 等位基因檢測(cè)結(jié)果 CRC 組織中I 等位基因和D 等位基因分布頻率分別為38.33%、61.67%，癌旁正常組織分別為56.67%、43.33%，以癌旁正常組織為參照，CRC 組織的OR 值為1. 423，95% CI 值為1.001 ～2. 002，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.043，P ＜0.05)。

3 討論

近30年來，隨著經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展，我國(guó)CRC 發(fā)病率也持續(xù)上升，特別是在城市人口中，CRC 發(fā)病率和死亡率均占到腫瘤發(fā)病率的前3 位［8］，這一情況與發(fā)達(dá)國(guó)家類似。很多患者確診時(shí)已失去手術(shù)根治機(jī)會(huì)，化療和靶向治療是主要的治療手段，因此，如何提高早期診斷率具有重要意義，其中，尋找和發(fā)現(xiàn)新的診斷和治療靶點(diǎn)可能是一條有效的捷徑，而對(duì)ACE 基因的深入研究也正契合這一方向。

近些年來，ACE 基因多態(tài)性與惡性腫瘤關(guān)系的研究日漸增多并取得很多成果。如非小細(xì)胞肺癌患者易患貧血與ACE 基因多態(tài)性有關(guān);ACE 基因中D 等位基因異常表達(dá)可能與口腔癌發(fā)病有關(guān);乳腺癌患者D等位基因表達(dá)異常增高;胃癌發(fā)病與ACE 基因多態(tài)性相關(guān)等。上述瘤種和ACE 基因多態(tài)性存在不同程度的關(guān)聯(lián)，大部分研究［9-11］認(rèn)為，多種腫瘤發(fā)生或分化程度和ACE 基因多態(tài)性相關(guān)，尤其與D 等位基因高表達(dá)相關(guān)聯(lián)，其機(jī)理可能與ACE 基因活性增高，導(dǎo)致Ang Ⅱ水平增高，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)腫瘤血管生成、影響腫瘤侵襲能力或分化程度等關(guān)系密切，從而影響腫瘤生長(zhǎng)和預(yù)后。

CRC 與ACE 基因多態(tài)性的關(guān)系近年來研究也較多，有一項(xiàng)研究［12］納入了241 例CRC 患者，通過對(duì)外周血中ACE 基因多態(tài)性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)D 等位基因攜帶者可能預(yù)后不良，但也有學(xué)者［13］進(jìn)行同類研究并未得出相同結(jié)論，這種矛盾的狀況說明ACE 基因多態(tài)性與CRC 的關(guān)系是復(fù)雜的，可能與人種差異等多因素相關(guān)。本課題組前期研究［2］報(bào)道人群中II 型純合子表達(dá)的增多與結(jié)腸癌發(fā)病相關(guān)，但I(xiàn)/D 等位基因與正常人比較無顯著差異。本研究中，我們對(duì)30 例CRC 患者腫瘤組織與癌旁正常組織ACE 基因多態(tài)性進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織ACE 基因多態(tài)性中，DD 型基因型增多者易患CRC，對(duì)等位基因分析表明，D 等位基因占優(yōu)勢(shì)的人群可能為結(jié)直腸癌的易患因素之一。

綜上所述，本研究結(jié)果是對(duì)CRC 腫瘤組織和癌旁正常組織的檢測(cè)結(jié)果，與前期外周血研究結(jié)果比較，有一定的新發(fā)現(xiàn)，如檢測(cè)腫瘤組織ACE 基因多態(tài)性對(duì)腫瘤的預(yù)測(cè)意義較外周血可能更有意義，同時(shí)也證實(shí)了外周血ACE 多態(tài)性研究結(jié)果，即D 等位基因與CRC發(fā)病相關(guān)，我們的研究與部分國(guó)內(nèi)外研究者的研究結(jié)論類似，初步說明ACE 基因多態(tài)性與CRC 發(fā)病有關(guān)，提示關(guān)注ACE 基因DD 基因型和D 等位基因可能對(duì)CRC 的診斷和預(yù)后提供有益信息，ACE 基因是否可能成為CRC 治療的新靶點(diǎn)值得進(jìn)行更深入的研究。

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