慢病毒載體PLKO.1-shHIF-2α的構建及鑒定

劉鵬飛，崔春萍，門同義

(1山東省醫學科學院，濟南250021;2濟南大學山東省醫學科學院醫學與生命科學學院;3軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所;4山東省千佛山醫院)

近20年來腎細胞癌的發病率和病死率不斷升高［1，2］，已經成為男性中第 7、女性中第 8 位的常見癌癥。研究證實，缺氧誘導因子(HIF)在腎癌的發生中起重要作用，其作為轉錄因子參與血管生成、腫瘤細胞的增殖、細胞的遷移等過程［3］。HIF由一個α 亞基(HIF-1α、HIF-2α 和 HIF-3α)和一個 β 亞基組成。β亞基作為結構單位穩定存在，而α亞基作為功能單位很不穩定，只有在低氧環境中存在;最近的研究表明HIF-2α在腎細胞癌的致癌中起重要作用。為研究HIF-2α表達對下游靶基因、細胞生物學特征和致癌能力的影響，我們構建了帶綠色熒光蛋白(GFP)并穩定干涉 HIF-2α的 PLKO.1-shHIF-2α的慢病毒載體，并對所得產物進行了鑒定。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 2×Taq PCR MasterMix試劑購于北京莊盟生物公司，凝膠回收試劑盒購于 Promega公司;DH5α大腸桿菌感受態細胞購自北京天根生物科技公司;大劑量質粒提取試劑盒購自Vigorous公司;小劑量質粒提取試劑購自威格拉斯公司。限制性內切酶 BamHl HF 、Spel HF、Agel、EcoRl和 T4 DNA 快速連接試劑盒購自NEB公司。人786-0細胞購于中國科學院上海細胞庫，質粒 PCDH、PLKO.1-puro、pMD2G，pSAX2及293FT細胞均由軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所保存。引物設計:HIF-2α干涉片段上下游引物分別為:5'-CAACCTGCAGCCTCAGTGTATC-3'和5'-CACCACGTCGTTCTTCTCGAT-3'。根據NCBI提供的PLKO.1-puro病毒包裝構建手冊合成包裝慢病毒的片段(北京奧克生物技術公司合成)，序列如下:5'-CCGGCAACCTGCAGCCTCAGTGTATCCTCGAGCACCACGTCGTTCTTCTCGATTTTTTG-3'和5'-AATTCAAAAACAACCTGCAGCCTCAGTGTATCCTCGAGCACCACGTCGTTCTTCTCGAT-3'。以質粒PCDH為模板，設計EF1-EGFP片段上下游引物分別為:5'-GGACTAGTAAGGATCTGCGATCGCTCCGGT-3'(含 Spel酶切位點)和 5'-CGGGATCCGCGAGATCCGGTGGAGCCGGGT-3'(含BamHl酶切位點)，由北京奧克公司進行合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 目的基因HIF-2α干涉片段和EF1-EGFP片段獲取 體外合成的單鏈HIF-2α干涉片段經過退火后形成雙鏈片段(95℃ 4 min，70℃ 10 min)。以PCDH質粒為模板，擴增EF1-EGFP片段，用2×Taq PCR MasterMix實行 PCR(94℃、30 s，60℃、2 min，35個循環;72℃延長10 min)，PCR產物1%瓊脂糖電泳后膠切割并膠回收，得到EF1-EGFP片段，預計約為 1.3 kb。

1.2.2 帶GFP的慢病毒載體質粒PLKO.1-shHIF-2α的構建 分別用AgeⅠ、EcoRⅠ雙酶切目的片段干涉HIF-2α序列和PLKO.1-puro質粒(37℃水浴3 h，70℃滅活20 min)，采用T4 DNA連接酶連接上述雙酶切的膠回收產物(16℃水浴18 h)。轉化感受態大腸桿菌DH5a，挑取陽性菌落，擴增后提取質粒。AgeⅠ、EcoRⅠ雙酶切鑒定(37℃水浴2 h)，預計得到1.9 kb的片段。鑒定連接成功后，將質粒與EF1-EGFP片段分別用BamHl HF和Spel HF雙酶切。再次用T4 DNA連接酶連接上述雙酶切的膠回收產物。轉化感受態大腸桿菌DH5a，挑取陽性菌落，擴增后提取質粒。BamHl HF和Spel HF雙酶切鑒定，預計得到1.3 kb的片段。

1.2.3 慢病毒載體 PLKO.1-shHIF-2α 的包裝及濃縮 具體方法參照文獻［4］。采用磷酸鈣沉淀法將載體質粒 PLKO.1-shHIF-2α 與 pMD2G，pSAX2共轉染293FT細胞。轉染12 h后更換完全培養基，72 h后收集上清液，無菌濾器過濾后得病毒原液。將病毒原液在超速冷凍離心機中3 000 r/min、4℃ 離心30 min，棄上清液，再以合適體積的IMDM重懸沉淀，使病毒顆粒充分懸浮，得到病毒濃縮液。整個過程在冰水混合物中進行，分裝后 －80℃凍存。

1.2.4 慢病毒載體 PLKO.1-shHIF-2α 的鑒定 在37℃、體積分數5%CO2、飽和濕度的培養箱中用RPMI1640培養液培養786-0細胞，細胞達80%匯合后傳代。收集適量的處于對數生長期的786-0細胞，加入96孔板中，每孔再加入不同稀釋倍數的病毒濃縮液，48 h后熒光顯微鏡下觀察GFP的表達情況。

2 結果

2.1 EF1-EGFP片段擴增結果 以PCDH為模板，PCR擴增出了帶BamHl和Spel接頭的EF1-EGFP片段，電泳顯示條帶大小與預期一致。見圖1。

圖1 EF1-EGFP片段PCR擴增結果

2.2 PLKO.1-shHIF-2α 干涉HIF-2α 片段鑒定 連接體系轉化感受態大腸桿菌DH5a約長出10個菌落，提取菌落質粒，用Agel和EcoRl雙酶切后電泳可見1.9 kb片段，表明PLKO.1-shHIF-2α 干涉HIF-2α片段連接成功。見圖2。

圖2 PLKO.1-shHIF-2α干涉HIF-2α片段

2.3 PLKO.1-shHIF-2α EF1-EGFP片段的鑒定 連接體系轉化感受態大腸桿菌DH5a約長出5個菌落，提取菌落質粒，用BamHl HF和Spel HF雙酶切后電泳可見1.3 kb片段，表明 PLKO.1-shHIF-2α 的EF1-EGFP片段連接成功。見圖3。

圖3 PLKO.1-shHIF-2α EF1-EGFP片段

2.4 測序結果 各連接點正確，序列與已知序列相符，表明干涉HIF-2α片段和EF1-EGFP片段已正確插入PLKO.1-puro質粒中，證實 PLKO.1-shHIF-2α質粒構建成功。

2.5 細胞感染效率 不同稀釋度的病毒濃縮液感染786-0細胞48 h后，在倒置熒光顯微鏡下可見96孔板內出現綠色熒光。以103稀釋度和106稀釋度為例，后者較前者熒光強度明顯降低，見圖4。

3 討論

近來研究發現HIF-2α在腎細胞癌中存在異常表達，與腎細胞癌發生發展存在密切的關系。Mandriota等［5］研究發現在腎透明細胞癌中檢測到更高的 HIF-2α表達，且表達增加與進展期腫瘤損害程度有關。Sowter等［6］研究證實，HIF-2α 的表達主要出現在腎透明細胞癌細胞中;研究還發現，HIF-2α與VHL、VEGF、TGF-α及cyclin-D1表達均有密切關系［7］。因此，為進一步研究HIF-2α表達對RCCs的生物學作用，以及其對下游靶基因的調控，建立穩定干擾HIF-2α的細胞株是必要的。

圖4 慢病毒載體感染786-0細胞48h的鑒定后GFP的表達

本研究中我們使用RNA干擾(RNAi)方法成功構建了帶GFP的HIF-2α干涉載體。RNAi是近年來發現的一種調節mRNA的生物學現象，能夠使基因表達的mRNA被相應的雙鏈RNA分子敲除，其效果要遠強于正義和反義RNA［8］，在治療腫瘤及病毒感染方面也展現了相當好的前景［9］。慢病毒載體作為最近實驗室經常采用的一種新型病毒載體，其優點是具有獲得病毒滴度高，周期短，可以感染非分裂細胞、分裂細胞，而且能夠整合到宿主基因組中，從而穩定的表達目的基因等特點。慢病毒干涉載體的技術是將慢病毒載體的特點和RNAi技術的優點結合到了一起，從而使得其能夠整合到宿主基因組從而發揮穩定的RNA干涉效果，使得在基因功能領域研究中RNA干涉技術的應用和作用得以更廣泛的發揮。本研究應用的PLKO.1-puro是一種復制缺陷型慢病毒載體，可以直接通過轉染操作被導入細胞，已經被作為常規RNAi載體使用，也可以被包裝成慢病毒顆粒，然后感染細胞。其一旦進入細胞內，就可以整合到基因組中，穩定表達shRNA和具有Puromycin抗性，Puromycin抗性基因的篩選可以殺滅掉沒有整合慢病毒載體的細胞且不穩定表達的細胞，從而得到基因組中有整合慢病毒載體的穩定的細胞系。同時GFP性質穩定，通常不影響目的基因表達產物的生物學活性，能根據GFP融合蛋白的綠熒光的分布來分析目的蛋白在細胞中的分布和定位，并且可以利用熒光顯微鏡直觀地判斷轉染效率，有利于篩選目的基因和GFP共表達的陽性細胞，從而得到持續表達該目的基因的細胞株［10］。我們在熒光顯微鏡下觀察到較強的綠色熒光，提示該融合質粒能在腎癌786-0細胞中成功表達，從而為進一步探究HIF-2α對腎癌細胞生物學行為的影響奠定了基礎。

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