mTORC1信號通路在花生四烯酸代謝產物致乳腺癌過程中的作用

劉 淼，張 月，何敏紅，周 玲，鄭 航

(南方醫科大學附屬南方醫院，廣州510515)

研究發現，高脂飲食女性發生乳腺癌的風險增加，食物中多不飽和脂肪酸如花生四烯酸(AA)攝入過多可增加乳腺癌發生的風險［1～4］。AA主要經過環氧化酶(COX)與脂氧合酶(LOX)途徑進行代謝;乳腺癌患者LOX代謝產物的表達增加［5，6］。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是調節細胞生長與代謝的中心信號分子，其過度激活可導致細胞增殖異常。乳腺癌患者存在mTOR信號通路的過度活化［7，8］。2012年12月～2013年6月，我們將LOX代謝產物5-羥二十烷四烯酸(HETE)、12-HETE及mTORC1抑制劑雷帕霉素(Rap)作用于體外培養的乳腺癌MCF-7細胞，探討mTORC1在5、12-HETE促進乳腺癌發生發展過程中的作用。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 乳腺癌MCF-7細胞株由本實驗室保存。DMEM培養基、胰酶及胎牛血清均購自GIBCO公司，5-HETE及12-HETE購自Cayman Chemical公司，Rap購自美國惠氏公司，β-actin、S6、山羊抗兔、兔抗山羊二抗購自Santa Cruz公司，P-S6(Ser235/236)抗體購自Cell Signaling Inc公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及干預 乳腺癌MCF-7細胞培養于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素及鏈霉素的DMEM培養液中，置于37℃、5%CO2孵箱內培養，根據細胞生長速度適時更換培養液，用0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA消化分散細胞，進行傳代或接種于6、24、96孔板培養。取生長狀態良好的細胞分為四組，對照組加入0.1%DMSO，HETE組加入5-HETE 及12-HETE 15 μmol/L，Rap 組加入 Rap 100 μmol/L，HETE+Rap 組加入 Rap 100 μmol/L 及 5-HETE+12-HETE 15 μmol/L。每一濃度設6個復孔，并設陰性對照，以空白孔調零。

1.2.2 檢測指標

1.2.2.1 細胞增殖率 采用CCK-8法檢測各組細胞增殖率。各組細胞培養72 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，放在培養箱內繼續作用4 h。采用酶標儀測定各組450 nm處測定光密度值，取6孔平均值表示MCF-7細胞增殖率。

1.2.2.2 mTORC1 通路蛋白表達 采用免疫印跡法檢測mTORC1通路下游蛋白P-S6(S235/236)的表達水平。各組細胞棄去培養板內培養基，加入細胞裂解液于冰上裂解，刮離細胞移入EP管內100℃煮沸10 min。將制備的蛋白樣品進行8% ～12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳1.5～2 h，Bio-Rad微型電轉移系統轉移至硝酸纖維素膜上(恒壓100 V，約90 min)。5%脫脂奶粉/TBST于平緩搖床上室溫封閉1 h，加入檢測蛋白的抗體(P-S6、S6及 β-actin)，于平緩搖床上室溫孵育4℃孵育過夜。TBST振蕩洗膜3次，加入相應二抗，室溫孵育1 h。洗膜3次加入化學發光試劑顯色1 min左右，于暗盒內與X線膠片貼在一起進行曝光，X線膠片經顯影、定影后掃描保存，檢測P-S6、β-actin蛋白灰度值。

1.2.2.3 細胞遷移距離 各組細胞接種至6孔板，常規培養至細胞密度長至100%開始進行劃痕試驗。加入2 μg/mL絲裂霉素、0.5%血清培養基中孵育24 h，然后使用200 μL移液槍頭自上而下劃一條痕。各組細胞加藥之后立即在顯微鏡下拍照并記錄劃痕的間距，分別于18、36 h后在顯微鏡下與前同樣方法拍照并記錄劃痕距離。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。數據以±s表示，方差齊時多組間比較采用方差分析，然后采用LSD法進行兩兩比較。方差不齊時采用Welch法行多組間比較，然后采用Dunnet＇s T3法進行兩兩比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞增殖率 對照組、HETE組、Rap組、HETE+Rap組細胞增殖率分別為 0.85 ±0.01、1.20 ±0.13、0.53 ± 0.08、0.54 ± 0.01，HETE 組細胞增殖率高于對照組，HETE+Rap組低于HETE組(P均＜0.05)。

2.2 mTORC1通路蛋白表達 對照組、HETE組、Rap組、HETE+Rap組 P-S6蛋白灰度值分別為83.51 ±5.06、127.4 ±9.34、47.07 ±3.58、56.24 ±4.49，HETE組P-S6蛋白水平高于對照組，HETE+Rap組低于HETE組(P均＜0.01)。見圖1。

圖1 各組P-S6蛋白表達水平

2.3 細胞遷移距離 HETE組MCF-7細胞18、36 h后遷移距離大于對照組(P＜0.01)。HETE+Rap組細胞遷移距離小于HETE組(P＜0.05)，與對照組相仿。見表1。

3 討論

AA是人體的一種必需脂肪酸，屬于n-6系列的多不飽和脂肪酸。AA廣泛參與自身免疫、過敏、哮喘、炎癥等多種生理過程，與腫瘤的形成與發展也密切相關。AA可被轉化為不同種類的類花生酸物質，可經 LOX途徑代謝為5-HETE、8-HETE、12-HETE、15-HETE等，可通過具有生物活性的代謝產物影響細胞信號轉導、細胞代謝，并與包括腫瘤在內的多種疾病發生有關，如激活P44/22有絲分裂原活化蛋白激酶和PI3K/Akt激酶途徑，可促進胰腺癌細胞內DNA合成。研究發現，乳腺癌患者乳腺癌組織中AA代謝產物5-LOX與12-LOX均有高表達，提示AA能增加患乳腺癌的風險，并與乳腺癌的進展程度和預后密切相關［9～11］。本研究發現，HETE 組MCF-7細胞增殖率高于對照組，提示5、12-HETE能夠促進乳腺癌細胞的增殖，在乳腺癌發生中起重要作用。

表1 各組MCF-7細胞遷移距離(μm，±s)

表1 各組MCF-7細胞遷移距離(μm，±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與 HETE 組比較，#P ＜0.05

組別 遷移距離18 h 36 h HETE 組 632.96 ±24.81 748.08 ±22.82#Rap 組 512.31 ±16.88 633.25 ±30.20#HETE+Rap 組 520.74 ±32.31 630.46 ±24.85#對照組506.83 ±24.66 617.37 ±15.79

mTOR是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在細胞內通過與其它分子形成復合物而行使生物學功能，目前認為主要形成mTORC1和mTORC2兩種復合物。它整合了營養、生長因子、能量代謝和應激等多個信號通路，控制細胞生長、增殖、存活與代謝，與細胞能量代謝、脂類合成、增殖、凋亡相關［12］。mTORC1下游的直接底物為S6K1及4E-BP1，核糖體蛋白S6作為S6K1的底物磷酸化后促進核糖體的發生，從而促進蛋白質合成及細胞增殖，可作為mTORC1活性檢測的重要指標。Rap是mTOR特異抑制劑，用于治療癌癥、抗移植排斥等［11］。本研究發現，5、12-HETE使 MCF-7細胞 mTORC1下游 S6的磷酸化水平升高，且這種磷酸化作用可被mTORC1抑制劑 Rap抑制;同時 Rap可抑制5、12-HETE對 MCF-7細胞的促增殖作用，提示5、12-HETE對MCF-7細胞的促增殖作用中存在mTORC1通路激活，說明mTORC1通路參與5、12-HETE促進乳腺癌發生的過程。

本研究發現，HETE組MCF-7細胞遷移距離大于對照組，HETE+Rap組細胞遷移距離小于HETE組，提示5、12-HETE可促進乳腺癌細胞的遷移，這種遷移作用可被mTORC1抑制劑Rap抑制，說明mTORC1參與了5、12-HETE促進乳腺癌遷移的過程。

綜上所述，mTORC1在5、12-HETE促進乳腺癌發生發展過程中發揮關鍵作用，這為乳腺癌發病機理提供新內容，為發展5、12-HETE及mTORC1抑制劑、單獨或聯合其他藥物治療乳腺癌的新策略提供了理論依據。

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