北豆根致大鼠肝損傷血清酶生物標(biāo)志物的早期變化及聯(lián)合檢測(cè)

喬靖怡金若敏姚廣濤陳華英徐婷婷

（1上海中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全評(píng)價(jià)研究中心，上海，201203；2河南中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心，鄭州，450008）

北豆根致大鼠肝損傷血清酶生物標(biāo)志物的早期變化及聯(lián)合檢測(cè)

喬靖怡1，2金若敏1姚廣濤1陳華英1徐婷婷1

（1上海中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全評(píng)價(jià)研究中心，上海，201203；2河南中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心，鄭州，450008）

目的：探討總膽汁酸（TBA）、α-谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（α-GST）等血清酶生物標(biāo)志物對(duì)北豆根致大鼠肝損傷早期診斷的應(yīng)用價(jià)值。方法：Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和北豆根低、高劑量組（22.5、45 g·kg-1），每組18只。給藥組每日灌胃給藥1次，連續(xù)21 d，對(duì)照組灌服等體積蒸餾水。分別于給藥7 d、14 d、21 d處理動(dòng)物，每組6只，收集血清，采用全自動(dòng)生化儀測(cè)定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（TB）以及TBA的水平，采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）測(cè)定血清α-GST、嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）、鳥(niǎo)氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶（OCT）和精氨酸酶Ⅰ（ArgⅠ）的水平；計(jì)算大鼠的肝臟指數(shù)及觀察肝組織病理學(xué)變化；應(yīng)用Logistic回歸和ROC曲線評(píng)價(jià)上述指標(biāo)對(duì)北豆根致大鼠肝損傷早期診斷的意義。結(jié)果：與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比，高劑量組給藥14 d ALP升高（P＜0.05），14 d、21 d ALT和肝臟指數(shù)升高（P＜0.05），組內(nèi)有2/6肝組織出現(xiàn)肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死、小灶性肝細(xì)胞壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；北豆根低劑量組肝臟指數(shù)于給藥21 d升高（P＜0.01）。北豆根高劑量組給藥7 d、14 d、21 d血清α-GST、PNP和ArgⅠ升高（P＜0.05或P＜0.01），OCT 14 d、21 d升高（P＜0.01），TBA 14 d升高（P＜0.05）。動(dòng)物血清中ALT、AST、α-GST、PNP和ArgⅠ各項(xiàng)的ROC曲線下面積（AUC）分別為0.787、0.483、0.957、0.948和0.934。其中ALT和AST聯(lián)合檢測(cè)的AUC為0.809，α-GST、ArgⅠ及與PNP聯(lián)合檢測(cè)的AUC為1.000，均高于各指標(biāo)單項(xiàng)檢測(cè)的AUC。結(jié)論：血清α-GST、PNP和ArgⅠ可作為北豆根致肝損傷早期的生物標(biāo)志物，且聯(lián)合檢測(cè)在北豆根致肝損傷早期有較高的診斷價(jià)值。

北豆根；肝損傷；血清酶生物標(biāo)志物；聯(lián)合檢測(cè)

目前臨床上常規(guī)檢測(cè)肝功能指標(biāo)主要有血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alamine aminotransferase，ALT）、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）等，但已有報(bào)道認(rèn)為上述指標(biāo)在肝損傷臨床檢測(cè)中其靈敏性和組織特異性方面有一定的局限性[1-2]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)作為潛在的肝毒性生物標(biāo)志物如總膽汁酸（total bile acid，TBA）、α-谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（αglutathione-S-transferase，α-GST）、嘌呤核苷磷酸化酶（purine nucleoside phosphorlyase，PNP）和精氨酸酶Ⅰ（arginaseⅠ，ArgⅠ）等在肝組織中特異性高，肝損傷時(shí)其靈敏度高于傳統(tǒng)指標(biāo)ALT和AST[3-5]。因此，探尋中藥肝毒性生物標(biāo)志物，早期評(píng)價(jià)中藥的肝臟毒性具有重要意義。中藥北豆根為防己科植物蝙蝠葛Menispermum dauricumDC.的干燥根莖。有小毒。性味苦寒，具有清熱解毒，祛風(fēng)止痛的功效[6]。北豆根在臨床上應(yīng)用廣泛，但文獻(xiàn)報(bào)道也可導(dǎo)致多種不良反應(yīng)，主要是腸道反應(yīng)，少數(shù)患者服藥后可出現(xiàn)惡心、腹痛、腹瀉及ALT升高[7]。本研究對(duì)中藥北豆根致大鼠肝損傷血清酶生物標(biāo)志物變化特征與常規(guī)血液生化指標(biāo)、肝組織病理學(xué)變化進(jìn)行比較分析，應(yīng)用ROC曲線的方法來(lái)評(píng)價(jià)酶學(xué)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)診斷肝損傷的價(jià)值，為北豆根臨床安全用藥、早期監(jiān)測(cè)肝損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物 北豆根（Rhizoma Menispermi，以下簡(jiǎn)稱RM），產(chǎn)地：黑龍江，批號(hào)120608，購(gòu)于安徽亳州市永剛飲片廠有限公司。經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院李西林副教授鑒定為防己科植物蝙蝠葛（Menispermum dauricumDC.）的干燥根莖。采用高效液相色譜法對(duì)北豆根藥材及其水煎液中的蝙蝠葛堿進(jìn)行含量測(cè)定，作為北豆根藥材及其水煎液的質(zhì)量控制。北豆根藥材中蝙蝠葛堿含量為0.39%，北豆根水煎液中蝙蝠葛堿含量為0.46 mg·m L-1。藥液的制備：稱取一定量北豆根藥材，加5倍量水浸泡1h，先武火煮沸，再文火煮0.5 h，趁熱過(guò)濾，再加入3倍量水，先武火煮沸，再文火煮0.5 h，趁熱過(guò)濾，合并2次藥液濃縮至4.5 g（生藥）· mL-1，4℃冷藏，備用。

1.2 主要試劑與儀器 ALT檢測(cè)試劑盒，R1，批號(hào)：J133，R2，批號(hào)：L129；AST檢測(cè)試劑盒，R1，批號(hào)：L134，R2，批號(hào)：L129；堿性磷酸酶（ALP）檢測(cè)試劑盒，R1，批號(hào)：J128，R2，批號(hào)：H128；總膽紅素（TB）檢測(cè)試劑盒，R1，批號(hào)：DK326，R2，批號(hào)：DK327；均由日本世諾臨床診斷制品株式會(huì)社生產(chǎn)。TBA檢測(cè)試劑盒，批號(hào)：120614；由煙臺(tái)澳斯邦生物工程有限公司生產(chǎn)。α -GST、嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）、鳥(niǎo)氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶（OCT）和ArgⅠ酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒，批號(hào)：201212；均由R＆D system生產(chǎn)，購(gòu)自基爾頓生物科技（上海）有限公司。日立7080全自動(dòng)生化分析儀，日本日和貿(mào)易有限公司；2-16K冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司；318-Microplate Reader酶標(biāo)儀，上海三科儀器有限公司。

1.3 動(dòng)物 Wistar大鼠，雌雄各半，54只，體重100～120 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005。動(dòng)物在上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)飼養(yǎng)室飼養(yǎng)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 取大鼠54只隨機(jī)分為3組，每組18只，雌雄各半，分別為對(duì)照組、北豆根低劑量組和高劑量組（以下簡(jiǎn)稱為L(zhǎng)-RM，H-RM）。給藥組分別灌服22.5 g／kg，45 g／kg北豆根水煎液，對(duì)照組灌服等體積蒸餾水10 m L／kg。每日1次，連續(xù)給藥21 d。各組分別于7 d、14 d、21 d處理動(dòng)物6只，稱量大鼠體重，以25%烏拉坦溶液1 g／kg麻醉動(dòng)物，腹主動(dòng)脈取血，4℃5000 r／min離心15 min，取血清。觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法：1）血清生化指標(biāo)檢測(cè)，采用全自動(dòng)生化儀測(cè)定血清肝功能ALT、AST、ALP和TB的水平。2）肝臟指數(shù)和組織病理學(xué)檢查，摘取肝臟，稱重并計(jì)算肝臟指數(shù)。另取肝左葉固定于中性福爾馬林溶液中，HE染色進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。3）血清酶生物標(biāo)志物檢測(cè)，采用全自動(dòng)生化儀測(cè)定血清總膽汁酸（TBA）的水平。采用ELISA測(cè)定血清中α-GST、PNP、OCT和ArgⅠ的水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差法，組間兩兩比較方差齊性時(shí)用LSD方法分析，方差不齊時(shí)用Dunnett’s方法分析。應(yīng)用Logistic回歸篩選變量并建立概率預(yù)測(cè)模型，對(duì)生成的預(yù)測(cè)變量及單項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行ROC曲線分析。

2 結(jié)果

2.1 北豆根對(duì)大鼠生化指標(biāo)的影響 與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比，北豆根低劑量組各項(xiàng)生化指標(biāo)無(wú)明顯變化；高劑量組ALT、ALP于給藥14 d起升高（P＜0.05），并呈現(xiàn)一定的時(shí)-量-效關(guān)系。見(jiàn)表1。

表1 北豆根對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響（±s，n＝6）

表1 北豆根對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響（±s，n＝6）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與L-RM組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

時(shí)間（d）組別ALT（U／L）AST（U／L）ALP（U／L）TB（μmol／L）304.33±77.12 677.50±107.32 0.71±0.28 3±0.47 L-RM 54.50±9.73 145.33±11.94 519.33±262.36 0.51±0.36 H-RM 58.00±8.97 147.50±21.53 535.00±228.49 0.36±0.10 14對(duì)照56.00±6.51 237.17±27.66 487.83±181.60 0.57±0.10 L-RM 55.67±8.26 240.50±44.58 672.17±233.45 1.73±0.80 H-RM 67.50±9.67*△251.83±28.98 736.83±167.94*0.85±0.48 21對(duì)照54.67±6.92 334.67±51.72 460.17±172.31 0.43±0.31 L-RM 49.50±10.54 317.33±50.35 612.83±268.75 0.67±0.25 H-RM 65.83±6.31*7對(duì)照52.00±10.55 150.00±21.32 558.50±185.04 0.5

2.2 北豆根對(duì)大鼠肝臟指數(shù)和組織病理學(xué)的影響與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比，北豆根低劑量組肝臟指數(shù)于給藥21 d升高（P＜0.01），高劑量組肝臟指數(shù)于給藥14 d起升高（P＜0.05），并呈現(xiàn)一定的時(shí)-量-效關(guān)系，見(jiàn)表2。光鏡下觀察，北豆根低劑量組動(dòng)物的肝臟組織未見(jiàn)明顯異常改變，高劑量組動(dòng)物的肝臟組織在21 d有2／6的動(dòng)物肝細(xì)胞出現(xiàn)點(diǎn)狀壞死、小灶性肝細(xì)胞壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖1。

表2 北豆根對(duì)大鼠肝臟指數(shù)的影響（±s，n＝6）

表2 北豆根對(duì)大鼠肝臟指數(shù)的影響（±s，n＝6）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與L-RM組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

時(shí)間（d）組別劑量（g／kg）肝臟指數(shù)（g／100g體重）3.49±0.14 L-RM 22.5 3.53±0.10 H-RM 45 3.56±0.15 14對(duì)照-3.15±0.24 L-RM 22.5 3.37±0.13 H-RM 45 3.42±0.17*21對(duì)照-2.95±0.16 L-RM 22.5 3.22±0.13**H-RM 45 3.20±0.14 7對(duì)照-*

圖1 北豆根對(duì)大鼠肝臟組織病理學(xué)的影響（HE染色×200）

2.3 北豆根對(duì)大鼠血清酶生物標(biāo)志物的影響 與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比，北豆根低劑量組TBA、α-GST、PNP、OCT和ArgⅠ無(wú)顯著差異，高劑量組α-GST、PNP和ArgⅠ于給藥7 d起升高（P＜0.05或P＜0.01），OCT于給藥14 d起升高（P＜0.01），TBA于給藥14 d升高（P＜0.05），呈現(xiàn)一定的時(shí)-量-效關(guān)系。見(jiàn)表3。

表3 北豆根對(duì)大鼠血清酶生物標(biāo)志物的影響（±s，n＝6）

表3 北豆根對(duì)大鼠血清酶生物標(biāo)志物的影響（±s，n＝6）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與L-RM組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

指標(biāo)組別時(shí)間（d）36.47±14.37 33.48±16.37 40.58±30.83（μmol／l）L-RM 47.42±21.33 36.07±13.27 46.33±30.37 H-RM 28.67±19.12 72.92±35.69**78.62±43.41 α-GST對(duì)照1129.21±202.72 1116.76±151.88 1050.43±214.82（mIU／L）L-RM 1291.21±184.39 1253.34±172.41 1454.93±253.25 H-RM 1528.95±140.01**1430.15±166.57*1556.47±108.95**PNP對(duì)照74.25±13.96 82.21±10.51 74.46±15.51（U／L）L-RM 74.61±20.47 96.27±13.50 97.81±17.31 H-RM 96.04±17.27*△118.67±13.31**125.96±15.59**OCT對(duì)照5.82±0.98 5.12±0.73 5.10±0.91（U／L）L-RM 6.61±0.99 6.59±1.19 6.41±1.32 H-RM 6.65±0.98 7.68±0.68**8.50±1.17**△△ArgI對(duì)照6.44±0.79 8.33±1.92 6.20±1.06（U／L）L-RM 7.18±0.87 8.01±1.13 7.84±1.56 H-RM 8.75±0.78**△12.03±0.50**△△10.67±1.26 14 21 TBA對(duì)照7 **△△

2.4 血清α-GST、PNP、ArgⅠ與ALT和AST單項(xiàng)檢測(cè) 早于ALT和AST變化的酶學(xué)指標(biāo)有α-GST、PNP和ArgⅠ，因此選取對(duì)照組及北豆根高劑量組動(dòng)物血清ALT、AST、α-GST、PNP和ArgⅠ檢測(cè)結(jié)果為檢驗(yàn)變量，以組別為狀態(tài)變量，定義對(duì)照組為組別0，定義肝損傷劑量北豆根組為組別1，作ROC曲線分析。各單項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)診斷肝損傷時(shí)，ALT和AST的ROC曲線下面積（AUC）分別為0.787和0.483；α-GST、PNP和ArgⅠ各項(xiàng)的ROC曲線下面積（AUC）分別為0.957、0.948和0.934。其中以α-GST、PNP和ArgⅠ的ROC曲線的AUC較高，與經(jīng)典指標(biāo)ALT和AST相比，具有較高的敏感性和特異性。見(jiàn)表4。

表4 血清ALT、AST、α-GST、PNP和ArgⅠ單項(xiàng)檢測(cè)的ROC曲線分析

2.5 相關(guān)性分析及聯(lián)合檢測(cè) 北豆根致大鼠肝損傷中α-GST、PNP和ArgⅠ與ALT相關(guān)性顯著（P＜0.05或P＜0.01）；α-GST、PNP和ArgⅠ之間兩兩相關(guān)（P＜0.01）。見(jiàn)表5。在單項(xiàng)檢測(cè)ROC曲線分析的基礎(chǔ)上，選取AUC＞0.9的3項(xiàng)指標(biāo)α-GST、PNP和ArgⅠ的檢測(cè)結(jié)果，經(jīng)Logistic回歸分析，得出肝損傷模型的概率預(yù)測(cè)模型，生成各檢測(cè)樣本的預(yù)測(cè)變量。以此方法，將α-GST、PNP和ArgⅠ檢測(cè)結(jié)果隨機(jī)組合后進(jìn)行Logistic回歸分析，再將預(yù)測(cè)變量作ROC曲線分析。其中α-GST和ArgⅠ以及α-GST、PNP和ArgⅠ聯(lián)合檢測(cè)，經(jīng)Logistic回歸分析模型預(yù)測(cè)變量的ROC曲線的AUC均為1.000，這在所有組合中ROC曲線的AUC最高，且高于經(jīng)典指標(biāo)ALT和AST組合（AUC為0.809）。由此表明指標(biāo)α-GST、PNP和ArgⅠ聯(lián)合檢測(cè)均優(yōu)于各指標(biāo)單項(xiàng)檢測(cè)。見(jiàn)圖2、表6。

表5 北豆根致大鼠肝損傷中ALT和AST與血清酶生物標(biāo)志物相關(guān)性分析

圖2 血清α-GST、PNP和ArgⅠ聯(lián)合檢測(cè)及ALT和AST聯(lián)合的ROC曲線

表6 血清α-GST、PNP和ArgⅠ聯(lián)合檢測(cè)及ALT和AST聯(lián)合的ROC曲線分析

3 討論

近年來(lái)，隨著中藥在臨床的應(yīng)用日益廣泛，有關(guān)中藥肝毒性的報(bào)道日益增多，據(jù)統(tǒng)計(jì)，占臨床藥物性肝損傷的4.8%～32.6%[8]，中藥所致的肝損傷在社會(huì)和中醫(yī)藥界得到廣泛關(guān)注。有時(shí)新藥在臨床前或臨床研究階段未發(fā)現(xiàn)肝毒性，而在新藥上市后撤市。因此，為了提高臨床前藥物安全評(píng)價(jià)的效率，并為藥物上市后監(jiān)測(cè)提供早期臨床安全評(píng)價(jià)指標(biāo)，需要探索更加敏感早期的生物標(biāo)志物來(lái)評(píng)價(jià)潛在的肝損傷以降低風(fēng)險(xiǎn)。

中藥北豆根的臨床應(yīng)用廣泛，除治咽喉腫痛外，還用于腸炎痢疾、風(fēng)濕疼痛、扁桃體炎、慢性氣管炎、高血壓、心率失常等。本品一般用量為3～6 g，不良反應(yīng)多因長(zhǎng)期或大劑量應(yīng)用導(dǎo)致。課題組前期研究顯示，北豆根中的成分蝙蝠葛堿100 g·mL-1能顯著降低人正常肝細(xì)胞的活力，能顯著升高肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的AST、ALP、LDH含量，提示蝙蝠葛堿對(duì)肝細(xì)胞具有一定的毒性作用[9]。由于北豆根在臨床上以湯劑口服為主，故本實(shí)驗(yàn)采用連續(xù)灌胃北豆根水煎液給藥方法。結(jié)果表明，多次給予大劑量北豆根水煎液可致大鼠肝損傷，表現(xiàn)為血清ALT、ALP明顯升高、2／6動(dòng)物肝臟組織病理學(xué)有所改變，且具有一定的時(shí)-量-效關(guān)系。

有文獻(xiàn)報(bào)道，大鼠在分別給予α-萘異硫氰酸酯（ANIT）、溴化苯（BrB）和硫代乙酰胺（TAA）三種物質(zhì)造成的明顯的肝毒性模型中，α-GST升高的程度要高于ALT、AST[10]。在半乳糖胺致大鼠肝毒性模型和內(nèi)毒素所致大鼠肝毒性模型中，大鼠血清PNP的升高出現(xiàn)的時(shí)間均早于ALT[11-12]。OCT在急性病毒性肝炎、肝性腦病時(shí)顯著升高，與ALT、AST、γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶（gamma-glutamyl transferase activity，GGT）呈正相關(guān)，在酒精性肝炎、藥物性肝炎時(shí)輕度升高[13]。此外，ArgⅠ是一種催化精氨酸生成鳥(niǎo)氨酸和尿素的水解酶，對(duì)氨起解毒作用。主要位于肝臟的胞漿內(nèi)，參與肝臟的尿素循環(huán)。有報(bào)道在硫代乙酰胺誘導(dǎo)的急性和慢性肝損傷實(shí)驗(yàn)中，血清中ArgⅠ升高的時(shí)間早于ALT、AST的變化，且升高的程度也大于ALT、AST[14]。

結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道以及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在北豆根致大鼠肝損傷實(shí)驗(yàn)中，首先，篩選肝損傷的早期敏感指標(biāo)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，北豆根高劑量組中血清α-GST、PNP和ArgⅠ于給藥7 d起就有明顯升高，均早于傳統(tǒng)生化指標(biāo)ALT、ALP及肝臟指數(shù)和肝組織病理學(xué)的變化。血清TBA、OCT指標(biāo)的變化與傳統(tǒng)指標(biāo)ALT的變化基本一致。因此，提示由北豆根致大鼠肝損傷血清酶指標(biāo)α-GST、PNP和ArgⅠ可作為肝損傷的早期敏感指標(biāo)；隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)，血液生化及肝組織病理學(xué)的變化也反映了北豆根致大鼠肝損傷。血清α-GST與谷胱甘肽代謝相關(guān)，指標(biāo)的升高與機(jī)體存在氧化損傷而調(diào)節(jié)氧化與抗氧化平衡有關(guān)，PNP與嘌呤核苷酸代謝相關(guān)，指標(biāo)的升高與肝竇內(nèi)皮細(xì)胞膜發(fā)生破壞有關(guān)，ArgⅠ是肝臟合成尿素的重要酶類(lèi)，這些單個(gè)血清酶的升高可提示肝臟的損傷。由于不同指標(biāo)反映了肝不同受損部位或損傷途徑，若聯(lián)合檢測(cè)幾種酶學(xué)指標(biāo)可以提高診斷的準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)采用ROC曲線綜合評(píng)價(jià)酶學(xué)指標(biāo)單項(xiàng)檢測(cè)和聯(lián)合檢測(cè)對(duì)肝損傷早期診斷的價(jià)值。

ROC曲線分析將敏感性和特異性結(jié)合，可以用于評(píng)價(jià)診斷試驗(yàn)的準(zhǔn)確性[15]。該方法在國(guó)內(nèi)外臨床醫(yī)學(xué)中有廣泛的應(yīng)用，有關(guān)肝腎損傷的綜合評(píng)價(jià)已有文獻(xiàn)報(bào)道[16-18]。單項(xiàng)檢測(cè)的ROC曲線分析顯示α-GST、PNP和ArgⅠ的AUC＞0.9有更好的診斷價(jià)值，且早于傳統(tǒng)指標(biāo)ALT升高，將這3項(xiàng)酶學(xué)指標(biāo)所得數(shù)據(jù)與傳統(tǒng)指標(biāo)ALT和AST進(jìn)行相關(guān)性分析和ROC曲線聯(lián)合檢測(cè)，可明顯提高其診斷肝損傷的敏感性和特異性。結(jié)果顯示，通過(guò)α-GST、PNP和ArgⅠ不同組合的聯(lián)合檢測(cè)比較，其中指標(biāo)α-GST和ArgⅠ2項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)及與PNP聯(lián)合檢測(cè)效能等同，均極大地提高了診斷肝損傷的敏感性和特異性（ROC曲線的AUC均為1.000），且高于傳統(tǒng)肝功能指標(biāo)ALT和AST聯(lián)合檢測(cè)效能（AUC為0.809）。綜合分析，提示血清α-GST、PNP和ArgⅠ聯(lián)合檢測(cè)可在臨床上更加早期敏感地監(jiān)測(cè)北豆根引起的肝毒性。

[1]Kumar M，Sarin SK，Hissar S，et al.Virologic and histologic features of chronic hepatitis B virus-infected asymptomatic patients with persistently normal ALT[J].Gastroenterology，2008，134（5）：1376-1384.

[2]Nathwani RA，Pais S，Reynolds TB，et al.Serum alanine aminotransferase in skeletal muscle diseases[J].Hepatology，2005，41（2）：380-382.

[3]Shimada T，Nakanishi T，Toyama A，et al.Potential implications for monitoring serum bile acid profiles in circulation with serum proteome for carbon tetrachloride-induced liver injury／regeneration model inmice[J]. J Proteome Res，2010，9（9）：4490-4500.

[4]Ozer J，Ratner M，Shaw M，et al.The current state of serum biomarkers of hepatotoxicity[J].Toxicology，2008，245（3）：194-205.

[5]耿興超，沈連忠，李波，等.肝毒性生物標(biāo)志物研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2011，46（10）：721-725.

[6]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（2010年版一部）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：65-66.

[7]童曉東.山豆根與北豆根的藥用比較[J].國(guó)醫(yī)論壇，2002，17（6）：41 -42.

[8]劉平，袁繼麗，倪力強(qiáng)，等.重視中藥的肝損傷問(wèn)題[J].中國(guó)新藥與臨床雜志，2007，26（5）：388-392.

[9]周倩，金若敏，姚廣濤，等.蝙蝠葛堿體外肝腎細(xì)胞毒性的初步研究[J].中國(guó)藥物警戒，2012，（10）：580-583.

[10]Giffen PS，Pick CR，Price MA，et al.Alpha-glutathione S-transferase in the assessment of hepatotoxicity——its diagnostic utility in comparison with other recognized markers in the Wistar Han rat[J].Toxicol Pathol，2002，30（3）：365-72.

[11]Ohuchi T，Tada K，Akamztsu K.Endogenous ET-1 contributes to liver injury induced by galactosamine and endotoxin in isolated perfused rat liver[J].Am J Physiol，1995，268（6 Pt1）：G997-1003.

[12]Mochida S，Arai M，Ohno A，et al.Deranged blood coagulation equilibrium as a factor ofmassive liver necrosis following endotoxin administration in partially hepatectomized rats[J].Hepatology，1999，29（5）：1532-1540.

[13]張一兵，王霞，張淑琴，等.鳥(niǎo)氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶速率法測(cè)定及其在肝病中的診斷意義[J].臨床肝膽病雜志，2010，26（1）：60-62.

[14]Murayama H，Ikemoto M，F(xiàn)ukuda Y，et al.Advantage of serum type-I arginase and ornithine carbamoyltransferase in the evaluation of acute and chronic liver damage induced by thioacetamide in rats[J].Clin Chim Acta，2007，375（1-2）：63-68.

[15]林衛(wèi)虹，廖偉嬌，鄭君德，等.Logistic回歸和ROC曲線綜合評(píng)價(jià)CEA、NSE和CYFRA21-1對(duì)肺癌的診斷價(jià)值[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2011，11（2）：185-188.

[16]喬靖怡，周璐，金若敏，等.四氯化碳致大鼠肝損傷早期血清總膽汁酸、α-谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、嘌呤核苷磷酸化酶和鳥(niǎo)氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶的變化[J].中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2013，27（4）：650-656.

[17]Alemayehu D，Zou KH.Applications of ROC analysis in medical research：recent developments and future directions[J].Acad Radiol，2012，9（12）：1457-1464.

[18]申俊，劉妍，張金曉.尿中腎損傷分子1水平升高對(duì)大鼠早期腎損傷的預(yù)測(cè)作用[J].中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2012，26（2）：212-218.

（2014-01-06收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng)）

Early Change and Determination of Serum Enzyme Biomarkers in Rats with Liver Injury Induced by Rhizoma Menispermi

Qiao Jingyi1，2，Jin Ruomin1，Yao Guangtao1，Chen Huaying1，Xu Tingting1
（1 Research Center for Drug Safety Evaluation，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai201203，China；2 Scientific Research Experiment Center，Henan College of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450008，China）

Objective：To evaluate the application value of serum enzyme biomarkers of total bile acid（TBA），α-glutathione-S-transfer-ase（α-GST）etc for the early diagnosis of liver injury induced by Rhizoma Menispermi（RM）in rats.Methods：Wistar rats were random ly divided into control group and RM low dose group（22.5 g·kg-1）and high dose（45 g·kg-1）group（n＝18）.RM 22.5 and 45 g·kg-1groups were treated with RM decoction by intragastrical administration，while the control group was given distilled water of the same volume once a day for21 consecutive days.Blood was collected respectively 7，14，21 days after RM administration.The levels of serum alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST），alkaline phosphatase（ALP），total bilirubin（TB）and TBA were measured by using automatic biochemical analyzer.The concentration ofα-GST，purine nucleoside phosphorlyase（PNP），ornithine carbamyl transferase（OCT）and arginaseⅠ（ArgⅠ）were detected with enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.Liver weight was measured and the pathological changes of liver tissue were observed.Logistic regression and ROC curve were applied to analyze the data of above indexes for evaluating the early diagnostic value of liver injury induced by RM.Results：Compared with that in the control group at the same time point，on day 14 the level of ALP was elevated（P＜0.05）and the level of ALT and liver weight index were increased（P＜0.05）and some spotty and focal necrosis，inflammatory cell infiltration in the liver tissue were demonstrated on day 14 and 21 in RM high dose group.The liver weight index was increased in RM low dose group（P＜0.01）. The levels ofα-GST，PNP and OCT were elevated on day 7，14 and 21（P＜0.05 or P＜0.01），and OCT increased on day 14 and 21，TBA increased only on day 14 in RM high dose group.The areas under the ROC curve（AUC）for serum ALT，AST，α-GST，PNP and ArgⅠwere 0.787，0.483，0.957，0.948 and 0.934 respectively.The AUC of the combined exam ination of ALT and AST was 0. 809.The AUC of the combined examination ofα-GST，ArgⅠand the AUC of the combined examination ofα-GST，ArgⅠand PNPwere the same of 1.000，higher than the AUC of single index examination.Conclusion：α-GST，PNP and ArgⅠmay be used as the biomarkers at the early stage of hepatic injury induced by RM.The combined examination has a higher value for the early liver injury diagnosis.

Rhizoma Menispermi；Liver injury；Serum enzyme biomarkers；Combined examination

R285.5

A

10.3969／j.issn.1673-7202.2014.02.009

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）項(xiàng)目（編號(hào)：2009CB522807）；國(guó)家科技重大專項(xiàng)（編號(hào)：2011ZX09301-009）

喬靖怡，女，博士，主要從事中藥藥理及毒理學(xué)研究，E-mail：qiaojingyi618＠126.com

金若敏（1948—），女，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥新藥研發(fā)及其安全性評(píng)價(jià)研究，Tel：（021）51322401，E-mail：rmj801＠126.com