商陸皂苷甲致腎細胞毒性的研究

周 倩 姚廣濤 金若敏 謝家駿

（上海中醫藥大學藥物安全評價研究中心，上海，201203）

商陸皂苷甲致腎細胞毒性的研究

周 倩 姚廣濤 金若敏 謝家駿

（上海中醫藥大學藥物安全評價研究中心，上海，201203）

目的：考察商陸皂苷甲Esculentoside A（EsA）對人腎小管上皮細胞（HK-2細胞）的毒性。方法：1）MTT法測細胞活力；2）檢測細胞上清液LDH、細胞內SOD及MDA；3）采用倒置顯微鏡及電鏡觀察細胞形態學；4）采用Hoechst-PI染色及流式細胞儀觀察細胞凋亡的情況。結果：1）EsA對腎細胞的活力有顯著的抑制作用，其IC50為149.11μg·mL-1，且存在一定的時效和量效關系；2）EsA能升高腎細胞培養上清中的LDH，使腎細胞內SOD／MDA比值有所下降；3）EsA能使腎細胞及其超微結構發生變化，出現凋亡或壞死，有一定的量效關系。結論：大于100μg·mL-1濃度的商陸皂苷甲對HK-2細胞有一定的毒性，其毒性機制與細胞氧化應激、凋亡等相關。

商陸皂苷甲；HK-2細胞；腎細胞毒性

商陸始載于《神農本草經》，為商陸屬植物商陸（Phytolacca acinosaRoxb.）和垂序商陸（Phytolacca americanaL.）的干燥根，為瀉下逐水藥，其性寒，味苦辛，有毒，歸肺、腎、大腸經[1]。現代研究顯示，商陸具有免疫調節及抗腫瘤、消炎抗菌、利尿等多種藥理作用，過量服用商陸的不良反應有神經系統和消化系統[2-5]，課題組研究曾指出，商陸能對大鼠的腎臟產生一定的毒性[6]。本文選用主要成分之一商陸皂苷甲，探討其對腎細胞的直接毒性。

1 材料

1.1 細胞株 HK-2細胞即人腎小管上皮細胞，由上海中科院細胞庫提供。

1.2 試劑及材料 商陸皂苷甲（上海融禾醫藥科技發展有限公司，純度＞98%，批號：120417）；DMEM／F12培養基（Gibco公司）；胎牛血清（Hyclone公司）；青霉素-鏈霉素抗體（Gibco公司）；胰蛋白酶（Sigma公司）；MTT、PI、Hoechst33342（Sigma公司）；LDH（日本世諾臨床診斷制品株式會社）；SOD、MDA、超微量蛋白（南京建成生物研究所）；二甲基亞砜（國藥集團化學試劑有限公司）。培養基配置：DMEM／F12+10%胎牛血清+1%雙抗。

1.3 儀器 BioTek全自動酶標儀；歐林巴斯BX51正置顯微鏡、IX70倒置系統顯微鏡；日立7080全自動血液生化儀。

2 方法

2.1 EsA對腎細胞活力的影響 將處于對數生長期的HK-2細胞經0.25%胰酶消化后制備成細胞懸液（細胞濃度為8×104個·mL-1），每孔加入180μL，培養24 h后分別加入6個不同濃度的EsA，每個濃度6孔，另設陰性平行對照組，置37℃、5%CO2培養箱中培養20 h，避光加入5 g／L MTT溶液20μL，繼續培養4 h。棄上清，加入二甲基亞砜（150μL／well），振蕩混勻，另設一調零孔（DMSO），于酶標儀檢測波長570 nm處測吸光度A，計算細胞活率。重復實驗3次。細胞活率＝（藥物組平均A-調零孔A）÷（對照組平均A -調零孔A）×100%。

細胞同上方法處理，培養24 h后加入EsA，使其終濃度為150μg·m L-1，分別于2、4、8、12、18、24 h，避光加入5 g／LMTT溶液20μL，繼續培養4 h。棄上清。加入二甲基亞砜（150μL／well），同上法測定吸光度A，重復實驗3次。

2.2 EsA對腎細胞上清液LDH、細胞內SOD及MDA的影響

2.2.1 上清液LDH的檢測 同2.1法將細胞懸液（細胞濃度為18×104個·mL-1）接種于24孔板。置37℃、5%CO2培養箱中培養24 h后，分別以含50、100、150、200μg·mL-1商陸皂苷甲的完全培養液處理細胞，另設陰性平行對照組，每組3孔。繼續培養24 h后，取細胞培養上清液，3000 r／min離心5 min，取上清液立即用日立7080全自動血液生化儀測LDH含量。2.2.2 SOD及MDA的檢測 將處于對數生長期的HK-2細胞經0.25%胰酶消化后制成細胞懸液，調整細胞濃度為25×104個·mL-1，接種于6孔板中。培養24 h后分別以含25、50、100μg·mL-1商陸皂苷甲的完全培養液處理細胞，另設陰性平行對照組。培養24 h后，胰酶消化收集各組細胞，用生理鹽水洗滌2次細胞后，用適量生理鹽水超聲裂解細胞，3000 r／min離心5 min后取適量上清液，檢測SOD及MDA，并對蛋白定量。

2.3 EsA對腎細胞形態的影響

2.3.1 倒置顯微鏡觀察細胞形態 同2.2.1法處理細胞后，以倒置顯微鏡觀察細胞形態。

2.3.2 電鏡觀察細胞形態 將HK-2細胞接種于100 mm培養皿中，置37℃、5%CO2培養箱中培養24 h后分別以25、50、100μg·m L-1商陸皂苷甲的完全培養液處理細胞，另設陰性平行對照組。培養箱中培養24 h后，棄上清，用PBS溶液洗滌2次，加入預冷電鏡液使細胞固定5 min，細胞刮刀刮下細胞于1.5 mL離心管中，1200 r／min離心5 min后棄上清，加入適量預冷的電鏡液置4℃冰箱保存細胞，送基爾頓生物科技有限公司進行電鏡檢測。

2.4 EsA對腎細胞凋亡的影響

2.4.1 Hochest33342-PI染色觀察腎細胞的凋亡／壞死 同2.2.1對細胞進行處理，給藥24 h后，于培養液中加入終濃度為10μg·mL-1的Hoechst33342，37℃反應10 min后，繼續加入終濃度為10μg·mL-1的PI，4℃反應20 min后，立即用倒置熒光顯微鏡觀察拍照。

2.4.2 流式細胞儀測腎細胞凋亡 將處于對數生長期HK-2腎細胞分別經0.25%胰酶消化后，接種于6孔板中，培養24 h后分別以含25、50、100、150μg· m L-1商陸皂苷甲的完全培養液處理細胞，給藥24 h后，用胰酶消化收集各組細胞，1200 r／min離心5 min后，棄上清，加入新鮮培養液后收集細胞于1.5 mL離心管中，交由上海中醫藥大學生化毒理室進行流式細胞檢測，采用方法：AnnexinV-PI測細胞凋亡。

2.5 統計學處理 SPSS 15.0軟件分析數據，實驗統計數據均用（ˉx±s）表示，單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊時用LSD法，方差不齊時用Dunnett’s法。P＜0.01和P＜0.05為有統計學意義；IC50用Bliss法計算。

3 結果

3.1 EsA對腎細胞活力的影響 與對照組相比，50～200μg·mL-1EsA組HK-2細胞活力明顯下降，有統計學意義（P＜0.01），且呈一定的劑量依賴性，IC50為149.11μg·m L-1，見表1。

與對照組相比，150μg·mL-1EsA作用2 h后，各組HK-2細胞活力均明顯下降，有統計學意義（P＜0.01），且呈一定的時間依賴性，見表2。

表1 EsA對HK-2細胞活力的影響（±s，n＝6）

表1 EsA對HK-2細胞活力的影響（±s，n＝6）

Note：*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

A Cell Viability／% Control—Group Dose／（μg·mL-1）0.322±0.006 100.00±1.86 EsA 200 0.054±0.015**16.77±4.66**150 0.157±0.011**48.76±3.42**100 0.272±0.009**84.47±2.80**50 0.291±0.002**90.37±0.62**25 0.318±0.005 98.76±1.55 12.5 0.315±0.008 97.83±2.48

表2 150μg·mL-1EsA對HK-2細胞活力的影響（±s，n＝6）

表2 150μg·mL-1EsA對HK-2細胞活力的影響（±s，n＝6）

Note：*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

Group Time（h）Cell Viability／% 2 0.629±0.018 100.00±2.86 0.384±0.011**61.05±1.75 Control A Cell Viability／% 150μg·mL-1EsA A ** 4 0.589±0.037 100.00±6.28 0.280±0.027**47.54±4.58**8 0.587±0.019 100.00±3.24 0.275±0.005**46.85±0.85**12 0.587±0.039 100.00±6.64 0.236±0.007**40.20±1.19**18 0.490±0.016 100.00±3.26 0.196±0.021**40.00±4.28**24 0.524±0.023 100.00±4.39 0.189±0.007**36.07±1.34**

3.2 EsA對腎細胞培養上清LDH、細胞內SOD及MDA的影響 與對照組相比，150和200μg·mL-1EsA組的HK-2細胞上清液中LDH含量明顯升高，有統計學意義（P＜0.01），見表3。

與對照組相比，25～100μg·mL-1EsA作用24 h后，各組的HK-2細胞中SOD、MDA分別出現相應的降低和升高現象，SOD／MDA明顯降低，見表4。

表3 EsA對HK-2細胞上清LDH的影響（±s，n＝3）

表3 EsA對HK-2細胞上清LDH的影響（±s，n＝3）

Note：**P＜0.01 vs control

Group Dose／（μg·m L-1）LDH／（IU·L-1）Control—65.67±1.53 EsA 200 172.33±2.52**150 147.00±3.61**100 67.33±4.93 50 64.00±1.00

表4 EsA對HK-2細胞SOD、MDA的影響

3.3 EsA對腎細胞形態的影響

3.3.1 顯微鏡觀察細胞形態 正常HK-2細胞間連接緊密，貼壁生長，形態呈鵝卵石樣，200μg·m L-1EsA組的腎細胞基本死亡漂浮于培養液中，150μg· mL-1EsA組的腎細胞數量大量減少、細胞皺縮變圓、部分死亡細胞漂浮于培養液中，100μg·mL-1EsA組的腎細胞數量明顯減少、少量細胞脫壁死亡，50μg· mL-1EsA組的腎細胞形態未發生明顯的改變，附圖1。

圖1 商陸皂苷甲（EsA）對HK-2細胞形態的影響（×200）

3.3.2 超微結構細胞形態 正常對照組HK-2細胞結構較完整、核形態不規則，100μg·mL-1EsA組大部分線粒體被破壞、細胞核中有明顯較大的圓形致密物，50μg·mL-1EsA組細胞核大、細胞膜和核膜扭曲內陷、大部分線粒體破壞及腫大，25μg·mL-1EsA組細胞核大小不等且不規則、線粒體腫大破壞，見圖2。

3.4 EsA對腎細胞凋亡／壞死的影響 Hoechst-PI染色顯示：正常細胞呈淡藍色，早期凋亡細胞呈亮藍色，晚期凋亡／壞死細胞呈橘紅色。正常對照組與50 μg·mL-1EsA組HK-2細胞基本正常，隨著藥物濃度增加，凋亡／壞死細胞不斷增加，200μg·mL-1EsA組的腎細胞基本均處于晚期凋亡或壞死狀態，呈現一定的量效關系，見圖3。

流式細胞儀檢測顯示：HK-2腎細胞在25～150 μg·mL-1EsA作用24 h后，細胞凋亡發生的比率由5.32%上升到18.46%，存在一定的量效關系，見表5。

圖2 商陸皂苷甲（EsA）對HK-2細胞亞顯微結構的影響

圖3 商陸皂苷甲（EsA）對HK-2細胞凋亡的影響（×200）

表5 商陸皂苷甲（EsA）對HK-2細胞凋亡的影響

4 討論

商陸皂苷甲（EsA）在商陸中的含量約為0.4%[7]，其既是商陸的主要及活性成分，又是其毒性成分之一。體內研究，給予大鼠商陸水煎液35 d可致腎臟損傷，其病理損傷主要表現為腎小管上皮細胞變性、蛋白管型，且恢復期部分損傷可逆[6]。文獻報道，商陸皂苷甲能夠引起BXSB小鼠腎小球和腎小管細胞的凋亡，其作用機理可能與下調BXSB小鼠腎組織中Bcl-2（凋亡調節蛋白）的表達和Bcl-2／Bax的比值從而加速細胞凋亡有關[8]。人腎小管上皮細胞（HK-2細胞系）是成人腎細胞，其功能接近原代培養的腎小管上皮細胞，已經成為研究各種藥物腎毒性及腎小管損傷機制的重要細胞模型[9-11]。

本研究表明，大于100μg·mL-1商陸皂苷甲對HK-2細胞（人腎小管上皮細胞）有明顯的毒性作用，提示商陸皂苷甲可能是中藥商陸致腎毒性的物質基礎之一，其對腎細胞毒性機制與致細胞氧化應激、凋亡相關。

[1]中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].一部.北京：化學工業出版社，2010.

[2]黃國英，劉星星.中藥商陸的藥理及應用研究[J].中國實用醫藥，2013，8（15）：249-250.

[3]趙國棟，王立寬，段靜，等.商陸不同極性、根和莖提取物的抑菌性能分析[J].基因組學與應用生物學，2010，29（4）：717-720.

[4]李一飛，姚廣濤.商陸藥理作用及毒性研究進展[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（13）：248-251.

[5]陳金香.中西醫結合治療急性商陸中毒26例[J].浙江中醫藥大學學報，2010，34（2）：221.

[6]李一飛，徐婷婷，姚廣濤，等.尿液NGAL，KIM-1，IL-18在商陸所致的大鼠腎損傷中的變化特征及其聯合檢測的意義[J].中國中藥雜志，2012，37（23）：3611-3617.

[7]馬杰，賴道萬，孫文基.商陸藥材中商陸皂苷甲的含量測定[J].藥物分析雜志，2010，30（1）：163-165.

[8]Hu Z，Qiu L，Xiao Z et al.Effects of esculentoside A on autoimmune syndrome induced by Campylobacterjejuni in mice and its modulation on T-lymphocyte proliferation and apoptosis[J].International Immunopharmacol，2010，10（1）：65-71.

[9]崔晉峰，邢凌霄，李增寧，等.赭曲霉毒素A對體外培養人腎小管上皮細胞凋亡的作用[J].細胞生物學雜志，2008，30（2）：243-246.

[10]魏佳莉，王暢，彭佑銘，等.黃芪對人腎小管上皮細胞細胞外基質分泌的影響及其機制探討[J].中國中西醫結合腎病雜志，2009，10（8）：664-667.

[11]閆長會，吳純啟，廖明陽.腎近端小管細胞系在藥物腎毒性評價中的應用[J].國外醫學藥學分冊，2003，30（4）：234-237.

（2014-01-06收稿 責任編輯：洪志強）

Study on Renal Cell Toxicity Induced by Esculentoside A

Zhou Qian，Yao Guangtao，Jin Ruomin，Xie Jiajun
（Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai201203，China）

Objective：To investigate the toxicity of Esculentoside A on HK-2 cells（Human renal tubular epithelial cells）.Methods：1）MTT assay was used to test the cell viability.2）The LDH in cells supernatant，SOD and MDA in the cells were detected.3）Morphological changes of the cells were observed through inverted phase contrast microscope and electron microscopy.4）Cell apoptosis was detected by Hochest33342-PI dyeing and flow cytometry.Results：1）Esculentoside A could inhibit nephrocyte viability dependently on time and dose（IC50 was149.11μg·mL-1）.2）Esculentoside A could increase the activity of LDH in nephrocyte supernatant，reduce SOD activity and increase MDA content in nephrocytes.3）Esculentoside A could cause damage of nephrocyte structure，cell apoptosis and necrosis.Conclusion：It showed that large dose of Esculentoside A（more than 100μg·m L-1）has toxicity on HK-2 cells and the mechanisms of toxicity may include cellular oxidative damage and cell apoptosis.

Esculentoside A；HK-2 cells；Renal cell toxicity

R285.5

A

10.3969／j.issn.1673-7202.2014.02.006

國家重點基礎研究發展計劃（973計劃）項目（編號：2009CB522807）；國家“十二五”科技重大專項課題“中藥安全評價技術平臺”（編號：2011ZX09301-009）

周倩（1988—），女，碩士研究生，中藥安全性評價，E-mail：423384692＠qq.com

姚廣濤，博士，副研究員，碩士生導師，從事中藥新藥及其安全性評價研究，Tel：（021）51322472，E-mail：ygt1969＠yahoo.com.cn