豬三種不同直徑卵泡中顆粒細胞的比較研究

鄧紅惠，耿果霞，賀亞媚，江中良，石美虹，陳華麗，李青旺＊

（1.西北農林科技大學動物科技學院，陜西楊凌712100；2.西北農林科技大學動物醫學院，陜西楊凌712100）

卵巢是母畜重要生殖器官之一，顆粒細胞是卵巢的主要功能細胞，其增殖分化直接影響卵泡發育、排卵啟動、黃體形成及類固醇激素的合成分泌等功能［1］。近年來以顆粒細胞作為生殖研究模型受到研究者越來越多的青睞。外源或內源物質通過與顆粒細胞相互作用進而影響卵巢生殖功能，甚至直接作用（Porter等［2］與Basini等［3］對催乳素的研究）。Jackowska等［4］研究發現不同直徑卵泡中卵母細胞的多種基因表達不同，為探究不同直徑范圍的有腔卵泡中顆粒細胞質量是否相同，本試驗將豬有腔卵泡按直徑分為大中小三種類型并獲得相應顆粒細胞進行分析，以期為后續生殖毒理學研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

成年豬卵巢采集自雨潤集團楊凌萬盛屠宰場。DMEM／F12培養基和胎牛血清購自Gibco公司，MTT，DMSO，Insulin 及BSA 購自Sigma 公司，RNA 提取及反轉錄試劑購自TAKARA 公司，熒光定量試劑均購自Vazyme公司，FSH（100IU／支）購自寧波第二激素廠。

1.2 方法

1.2.1 卵巢顆粒細胞的分離與培養 從屠宰場獲取成年豬卵巢，置于37 ℃含1%青鏈霉素的生理鹽水中，30 min 內帶回實驗室。滅菌清洗后，借鑒Jiang 等［5］的方法，剖剪出卵巢內三種直徑范圍的有腔卵泡（＜2 mm，2～5 mm，≥5 mm），分別置于DMEM／F12中，并清洗3次。轉移入60 mm 無菌平皿，十字狀剪破卵泡，使卵泡液充分流出，400目篩網過濾，收集細胞混合液，800r／min離心5min，洗滌顆粒細胞3次。用添加0.3%BSA，50ng／mL胰島素，0.1IU／mL FSH，3% FBS，100IU／mL 青霉素，100mg／ml鏈霉素的DMEM／F12完全培養液重懸細胞，臺盼藍染色計數，調整細胞密度為5×105／mL后接種于培養板，置于37 ℃，5%CO2條件下培養。……