長鏈非編碼RNA NEAT1對小鼠精子發(fā)生的影響

胡 源，曾文先

（西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西楊凌712100）

長鏈非編碼RNA（lncRNA）具有在細胞特異性表達的特性［1］，參與形成細胞核中的亞結構并調節(jié)多種細胞活動和生物學過程，包括調控基因表達和蛋白質的活性、干細胞自我更新與分化等［2］。但關于lncRNA 在小鼠精子發(fā)生過程中的作用及其調節(jié)機理目前尚未見報道。lncRNA NEAT1作為核心組分參與形成旁斑（paraspeckle）結構［3］。敲除NEAT1影響DBHS（Drosophila melanogaster behavior，human splicing）蛋白在細胞中的定位，從而影響旁斑結構的形成［4－5］。而旁斑可以阻滯成熟mRNA 的出核與后續(xù)翻譯［6］，參與調控細胞的分化和生長［7，8］。在細胞分化的過程中NEAT1的表達升高［9－11］。本研究旨在探索NEAT1對維持小鼠精子發(fā)生所起的作用，為雄性動物的精子發(fā)生過程和生殖研究提供試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及細胞系

試驗動物：C57BL／6J小鼠，昆明種小白鼠。細胞系：GC－1精原細胞系，293T 細胞系。病毒包裝系統(tǒng)：CD513B－U6表達質粒及包裝質粒（pVSV－G、pGag－Pol、pRsv－rev）。

1.2 主要試劑與儀器

PCR 擴增儀；凝膠電泳成像分析系統(tǒng)（Biorad）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo）；超凈工作臺（蘇州）；臺式低溫離心機（Sigma）；超純水制備系統(tǒng)（Mill－Q）；立式壓力蒸汽滅菌鍋；熒光倒置顯微鏡（Olympus），二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo）。

1.3 NEAT1表達檢測

RNA 提取：使用Trizol法提取細胞總RNA；反轉錄PCR：使用TaKaRa 公司PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒；PCR：使用TaKaRa公司Ex Taq?試劑盒，引物信息如下：

上游引物：TACATGGGGGCAGTGTCCTA

下游引物：ACCACAGAAGAGGAAGCACG

1.4 干擾載體構建

包括設計shRNA；CD513B－U6質粒雙酶切：使用BamHI和EcoRI限制性內切酶進行雙酶切；構建CD513B－U6－shRNA 載體及測序。

表1 NEAT1的shRNA 序列信息Table 1 The shRNA sequence information of NEAT1

1.5 慢病毒包裝與滴度測定

使用 CD513B－U6－shRNA 載體、pVSV－G1、pGag－Pol、pRev ug包裝載體，轉染293T 細胞系進行病毒包裝；采用倍比稀釋法測定慢病毒的滴……