紅茶添加對靈芝菌液態發酵產胞外多糖的影響

高佳佳，劉書來，丁玉庭

（浙江工業大學生物與環境學院，浙江杭州 310014）

紅茶添加對靈芝菌液態發酵產胞外多糖的影響

高佳佳，劉書來，丁玉庭

（浙江工業大學生物與環境學院，浙江杭州 310014）

通過添加紅茶對靈芝菌液態發酵產胞外多糖（EPS）影響的研究表明，培養基中添加紅茶對靈芝菌液態發酵的菌體干重和EPS產量均有顯著影響。當紅茶添加量為2.5%時，對EPS產量的提高有顯著的促進作用，為0.985 g?L-1，比對照組增加80.2%；而菌體干重為7.818 g?L-1時，比對照組下降43.6%。同時研究了在最適紅茶添加量條件下，靈芝菌發酵菌體干重和胞外多糖EPS產量的變化過程，驗證了其生物量與產物生成呈部分偶聯型的代謝規律。

紅茶添加；靈芝菌；菌體干重；胞外多糖（EPS）

靈芝菌（Ganoderma lucidum）是名貴的藥食兩用真菌，屬真菌門擔子菌亞門層菌綱非褶菌目靈芝菌科靈芝屬［1］，在我國有2 000多年的食用歷史，是滋補強壯、扶正固本之珍品，具有免疫調節、抗腫瘤［2］、清除機體自由基抗氧化［3］等多種功效。靈芝菌富含多種生理活性成分，主要為靈芝多糖和靈芝三萜等，其中靈芝多糖（EPS）的研究較為深入。由于傳統的靈芝培養方式栽培期長且效率低下，故而隨著深層液體發酵培養技術的發展，靈芝菌的開發利用即從固態的子實體轉向了液體發酵的菌絲體。

我國是世界上產茶大國之一，茶制品的科技含量與附加值卻較低。紅茶在世界茶消費中占80%，其生物活性逐漸引起研究者的重視，因其營養成分豐富，存在茶多糖、維生素、微量元素等［4］特殊誘導因子，可促進靈芝菌EPS的合成，故而考慮利用紅茶與靈芝菌進行混合發酵研究，不僅豐富了茶制品的營養與保健因子的種類與數量，還開辟了研發功能性保健品的新途徑。此外，靈芝菌發酵過程中會代謝產生氨基酸和多酚氧化酶，降解紅茶中的多酚類物質，提高氨基酸含量，從而改變紅茶主要呈味物質的協調關系，改善其口感及品質。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試劑

供試材料為普通紅茶，購于杭州茶葉市場。供試菌種為鹿角靈芝（Ganoderma lucidum），由浙江工業大學食品系保存。試劑包括無水乙醇、苯酚、濃硫酸，均為分析純。

1.2 培養基

參照文獻［5］開展試驗。

斜面種子培養基。為PDA瓊脂培養基。

種子液培養基。每升加入葡萄糖20 g，甘油30 g，牛肉膏2.5 g，蛋白胨5.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，維生素B10.05 g，碳酸鈣1.0 g，初始pH值5.5。

發酵培養基。每升含葡萄糖30 g，甘油30 g，牛肉膏2.5 g，蛋白胨5.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，維生素B10.05 g，碳酸鈣1.0 g，紅茶6.0 g，初始pH值5.5。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化

斜面保藏菌種室溫下放置5 h后，接入新配制的PDA瓊脂培養基中，30℃活化5 d待用。

1.3.2 種子液培養

將活化后菌種切成5 mm×5 mm大小塊狀，取5塊菌種接入100 m L新配制的種子液培養基（裝于500 mL三角瓶）中，30℃，150 r·min-1條件下培養3 d待用。

1.3.3 發酵培養

取6%種子液接入50 m L新配制的發酵培養基（裝于100 mL三角瓶）中，30℃，150 r·min-1條件下發酵培養9 d，每2 d取3瓶發酵液樣品進行指標測定。

1.3.4 菌體干重測定

將樣品恒重后用濾紙過濾，得到菌絲體濾渣，85℃恒重后稱量記錄數據。

1.3.5 EPS測定

苯酚硫酸法［5-6］。

1.3.6 菌體干重增加率與EPS增加率的計算

菌體干重增加率／%＝（試驗組菌體干重-對照組菌體干重）／對照組菌體干重×100。

EPS增加率／%＝（試驗組EPS產量-對照組菌體干重）／對照組菌體干重×100。

1.3.7 數據分析

采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析和LSD多重比較，判斷紅茶添加對靈芝菌發酵菌體干重和EPS產量影響的顯著性。

2 結果與分析

2.1 紅茶添加量對靈芝菌發酵菌體干重和EPS產量的影響

考查紅茶添加量分別為0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%和3.0%的條件下，靈芝菌發酵7 d后，對菌體干重和EPS產量的影響如圖1和2所示。

圖1 紅茶添加量對靈芝菌發酵菌體干重的影響

試驗結果表明，不添加紅茶的對照組發酵后最大菌體干重為13.853 g?L-1，而添加紅茶的各試驗組其最大菌體干重均明顯低于對照組，其中紅茶添加量為2.5%和3.0%的試驗組菌體干重分別比對照組下降了43.6%和42.4%，最大菌體干重分別為7.818和7.976 g?L-1，均低于試驗組（圖1）。經方差分析和LSD多重比較分析可知，不添加紅茶的對照組與添加紅茶的試驗組間菌體干重差異顯著，即紅茶的添加對靈芝菌發酵菌體干重的影響顯著。而不同紅茶添加量的試驗組間，紅茶添加量為2.5%，3.0%試驗組的菌體干重分別與紅茶添加量為0.5%的試驗組差異顯著，其他試驗組間差異不顯著。

如圖2所示，紅茶添加后試驗組的最大EPS產量均有所提高，其中紅茶添加量為2.5%的試驗組EPS產量相較于各試驗組最高，達到了0.985 g?L-1，比對照組增加了80.2%。由此可知，紅茶添加量為2.5%時，最有利于EPS產量的提高。經方差分析和LSD多重比較可知，不添加紅茶的對照組與添加紅茶的試驗組間EPS產量差異顯著，即紅茶的添加對靈芝發酵EPS產量影響顯著。而不同紅茶添加量的試驗組間差異顯著性，紅茶添加量為2.5%的試驗組EPS產量與其他添加量的試驗組之間差異顯著，紅茶添加量為0.5%的試驗組與添加量分別為2.0%，2.5%，3.0%的試驗組差異顯著，添加量為1.0%的試驗組與2.0%，2.5%，3.0%的試驗組差異顯著，添加量為2.0%的試驗組與0.5%，1.0%，2.5%的試驗組差異顯著，添加量為3.0%的試驗組與0.5%，1.0%，2.5%的試驗組差異顯著。

圖2 紅茶添加量對靈芝菌發酵EPS產量的影響

結合圖1和2及數據分析可知，紅茶添加量為2.5%對靈芝菌發酵菌體干重和EPS產量影響最為顯著，故選擇2.5%作為最適紅茶添加濃度。根據菌體生情況，推斷出紅茶中含有抑菌物質，在靈芝菌發酵過程中，抑制了菌體干重的增長，同時卻促進了EPS產量的提高。而從EPS的抗氧化、抗腫瘤和調節免疫等生理活性角度考慮，EPS產量的提高具有重要意義。

2.2 最適紅茶添加量條件下菌體干重和EPS產量變化過程分析

在2.5%的最適紅茶添加量條件下，考察了靈芝菌發酵過程中菌體干重和EPS產量的變化情況（圖3）。紅茶的添加抑制了靈芝菌菌體的生長，在0～3 d內，對照組的菌體生長經短暫的適應期后呈指數型增長；而試驗組由于紅茶中多酚類物質對靈芝菌生長的抑制作用使其適應期較長，生長較為緩慢。在3～5 d內，對照組的菌體生長速率減慢，開始進入穩定期；而試驗組逐漸適應了茶葉中的多酚類物質，生長速率稍有增加。5 d后，對照組菌體開始自溶，菌體干重逐漸減少；而試驗組菌體經過前期的適應，生長速率增加，在7～9 d內，經過穩定期開始自溶。

圖3 添加2.5%紅茶靈芝菌發酵過程中菌體干重變化

靈芝菌發酵過程中EPS產量變化見圖4。紅茶本身存在茶多糖，在靈芝菌未開始發酵前，培養環境中即存在少量多糖。在0～3 d內，試驗組的多糖有先減少后增加趨勢，而對照組EPS產量則快速增加。3～5 d內，對照組進入穩定期，EPS產量逐步積累至最大0.547 g?L-1；試驗組菌體開始適應紅茶多酚類物質環境，且在各種有利于EPS生成的誘導因子促進下，EPS合成速率明顯增加。5 d后，由于對照組菌體開始自溶，底物耗完，部分未自溶菌體利用已合成的胞外多糖滿足自身生長，故EPS產量逐漸下降；而試驗組靈芝菌的生長環境中底物未耗完，有利于EPS產量進一步增加，直至7 d達到最大產量0.985 g?L-1。

圖4 添加2.5%紅茶后靈芝菌發酵過程中EPS產量變化

從圖3和4得知，2.5%紅茶中既存在抑制靈芝菌菌體生長的多酚類物質，又存在可以促進EPS合成和釋放的各種誘導因子。此外，當靈芝菌菌體生長處于穩定期時，EPS的合成處于快速生長期，由此可見，靈芝菌的菌體生長和EPS合成屬于部分偶聯型的代謝［7］。

3 小結與討論

紅茶中富含多種蛋白質、氨基酸、生物堿、茶色素、茶多糖和維生素及礦物質，其營養豐富，有利于促進靈芝菌EPS的合成，同時紅茶也含有具抑菌作用的多酚類物質。靈芝菌在發酵過程中會分泌一種能降解多酚類物質的多酚氧化酶，該酶可降解發酵液中的多酚，減少多酚類物質對靈芝菌菌體生長的影響，積累更多的胞外代謝產物［8］。因此，紅茶添加到靈芝菌發酵過程中，培養基中含少量的多酚類物質，誘導靈芝菌合成多酚氧化酶，而多酚氧化酶的合成又可進一步降解多酚類物質，進而緩解多酚類物質對靈芝菌菌體生長的抑制，從而促使靈芝菌分泌胞外代謝產物EPS，達到提高EPS產量的目的。

由試驗結果可以推測，2.5%紅茶添加量中所含的多酚類物質濃度可能在靈芝菌發酵體系中處于一種最適平衡濃度，故而能最大限度地提高靈芝菌EPS產量。同時，由于紅茶中豐富的營養成分可以進一步誘導靈芝菌合成EPS，因此添加2.5%紅茶后，靈芝菌EPS產量比對照組提高81.2%。

在發酵開始的0～3 d適應期，靈芝菌未及時合成多酚氧化酶，靈芝菌菌體生長受到多酚類物質抑制，而紅茶中本身存在的茶多糖被靈芝菌利用滿足自身生長，EPS產量先減少后增加。3 d后，隨著多酚氧化酶的合成，多酚類物質逐漸被降解，靈芝菌菌體逐漸適應生長環境開始進入快速合成EPS階段直至7 d后穩定期結束菌體自溶，EPS產量下降。

綜上所述，紅茶的添加對靈芝菌液態發酵產EPS具有積極作用，而關于這方面的研究較少，具體機制也有待進一步研究。

［1］ 陳娜.靈芝菌液態發酵及其多糖抗氧化活性研究［D］.廣州：華南理工大學，2012.

［2］ Zhao S F，Ye G，Fu G D，et al.Ganoderma lucidum exerts anti?tumor effects on ovarian cancer cells and enhances their sensitivity to cisplatin［J］.International Journal of Oncology，2011，38（5）：1319-1327.

［3］ Zhao W，Jiang X J，Deng W W，et al.Antioxidant activities of Ganoderma lucidum polysaccharides and their role on DNA damage inmice induced by cobalt-60 gamma?irradiation［J］. Food and Chemical Toxicology，2012，50（2）：303-309.

［4］ 徐永成.世界茶業經濟及發展趨勢［J］.中國茶葉，2002，24（4）：3-4.

［5］ 徐淑蓓，劉書來，丁玉庭.多菌種復合發酵對靈芝菌產胞外多糖的影響［J］.浙江工業大學學報，2012（4）：428-430，468.

［6］ Dubois M，Gilles K A，Hamilton J K，et al.Colorimetric method for determination of sugarsand related substances［J］. Analytical Chemistry，1956，28（3）：350-356.

［7］ 李平作，章克昌.靈芝胞外多糖分批發酵非結構動力學模型［J］.生物技術，1999，9（3）：24-26.

［8］ 殷亞峰，丁玉庭，歐陽喆，等.茶汁中靈芝菌產多酚氧化酶發酵條件的研究［J］.浙江工業大學學報，2005，33（4）：390-394.

（責任編輯：張瑞麟）

S 567 < class="emphasis_bold">文獻標志碼：B

B

0528?9017（2014）01?0082?03

文獻著錄格式：高佳佳，劉書來，丁玉庭.紅茶添加對靈芝菌液態發酵產胞外多糖的影響［J］.浙江農業科學，2014（1）：82-85.

2013?10?04

高佳佳（1987-），女，浙江杭州人，碩士研究生，從事食品生物技術方面研究工作。E?mail：gaojiajia1123＠163.com。

劉書來（1977-），男，山東菏澤人，博士，副教授，研究方向為食品生物技術。E?mail：slliu＠zjut.edu.cn。