商洛野生蕙蘭基因組DNA提取方法的比較

李小玲，華智銳

（商洛學院生物醫藥工程系，陜西商洛 726000）

商洛野生蕙蘭基因組DNA提取方法的比較

李小玲，華智銳

（商洛學院生物醫藥工程系，陜西商洛 726000）

為探討野生蕙蘭基因組DNA最佳提取方法，本研究以商洛野生蕙蘭幼嫩葉片為材料，采用SDS、CTAB、高鹽CTAB法提取商洛野生蕙蘭的基因組DNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳對所提取DNA進行完整性檢測，用紫外分光光度法對DNA進行純度、濃度和提取率檢測。結果表明，3種方法所提DNA的濃度分別為2 223，2 980和3 371μg·mL-1，提取率分別為222.3，298.0和337.1μg·g-1，D260／D280分別為1.583，1.672和1.967，高鹽CTAB所提取DNA的D260／D280比值1.8～2.0，濃度、純度及提取率均最高，電泳條帶清晰，由此初步確定3種方法中高鹽CTAB法為商洛野生蕙蘭基因組DNA最佳提取方法。

野生蕙蘭；基因組DNA；提取方法；比較

蕙蘭（Cymbidium faberi）為蘭科蘭屬的地生草本植物。蕙蘭是我國珍稀物種，為國家二級重點保護野生物種。蕙蘭原分布于秦嶺以南、南嶺以北及西南廣大地區，是比較耐寒的蘭花品種之一。在秦巴山區不少地方均有分布，商洛一帶蘭花的分布也很廣泛，其中就有蕙蘭。

DNA是分子研究的基礎物質，其提取技術則成為分子生物學的基本技術［1］。DNA的濃度，尤其是DNA的純度嚴重影響后續基因組酶切等結果［2］。由于蕙蘭花朵中的酚類、多糖類物質含量較高，所以從葉片中提取出高質量的DNA樣本有一定的難度，其提取方法的確定及優化需要不斷摸索。本研究選取SDS法［3］、CTAB法［4］、高鹽CTAB法［5-6］3種DNA提取方法，旨在通過對商洛野生蕙蘭葉片基因組DNA提取效果進行比較，探討適合蕙蘭基因組DNA的提取方法，為蘭花分子生物學的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料預處理

野外采集商洛野生蕙蘭幼嫩葉片，蒸餾水洗去塵土，晾干，放入-20℃冰箱預冷備用。

1.2 儀器與試劑

主要儀器：人工氣候箱、超低溫冰箱、制冰機、紫外分光光度計、電子天平、高壓滅菌鍋、超純水儀、移液器、核酸電泳儀、恒溫水浴鍋、水平電泳槽、凝膠成像系統等。

主要試劑：SDS（十二烷基磺酸鈉）、CTAB（十二烷基溴化氨）、EDTA（乙二胺四乙酸）、氯化鈉、β?巰基乙醇、氯仿／異戊醇、異丙醇、RNase A、Tris?HCl、醋酸鉀、瓊脂糖、溴酚藍、Marker DL2000、蔗糖、硼酸、無水乙醇等。

1.3 溶液配制

1.3.1 1 mol·L-1Tris?HCl溶液（pH值8.0）

將12.11 g Tris堿溶于80 mL超純水中，待溶液冷卻至室溫后，用濃鹽酸調定pH值至8.0，定容至100 m L后，分裝、高壓滅菌，室溫保存備用。

1.3.2 0.5 mol·L-1EDTA溶液（pH值8.0）

將18.61 g EDTA?Na2·H2O溶于80 mL超純水中，用固體氫氧化鈉調節溶液的pH值至8.0，定容至100 mL，分裝后高壓滅菌，室溫保存備用。

1.3.3 5 mol·L-1NaCl溶液

將29.22 gNaCl溶于80 mL超純水中，定容至100 mL，分裝后高壓滅菌，室溫保存備用。

1.3.4 50%PVP溶液

25 g PVP（相對分子質量10 000）溶于80 mL超純水中，定容至100 mL，高壓滅菌，室溫保存備用。

1.3.5 10×CTAB抽提液

將14 mL 5 mol·L-1NaCl與66 mL超純水混合，在加熱和攪拌下緩慢加入10 g CTAB。可加熱至65℃，使之溶解，定容至100 mL，室溫保存備用。

1.3.6 3 mol·L-1乙酸鈉溶液（pH值5.2）

40 mL去離子水中加40.81 g三水合乙酸鈉，用冰醋酸調pH值至5.2，再加稀醋酸定容100 mL，高溫滅菌，室溫保存備用。

1.3.7 10 g·L-1RNase A溶液

取RNase A 100 mg、1 mol·L-1Tris?HCl（pH值7.5）0.1 m L、5 mol·L-1NaCl2.8 mL、超純水7.0mL混合，攪拌使RNase A充分溶解，100℃加熱15 min，冷卻至室溫后定容至10 mL，10 000 r·min-1離心15min，取上清液分裝，于-20℃保存備用。

1.3.8 10%SDS溶液

將10 g SDS溶于80 mL超純水中，定容至100 mL，分裝后高壓滅菌，室溫保存備用。

1.3.9 SDS提取緩沖液（現用現配）

將1 mol·L-1Tris?HCL（pH值8.0）10 mL、0.5 mol·L-1EDTA（pH值8.0）10 mL、5 mol· L-1NaCl10 mL、10%SDS 20 mL、50%PVP 5 mL、100%β?巰基乙醇1 m L、超純水44 mL混勻備用（100 mL）。

1.3.10 2×CTAB提取緩沖液（現用現配）

將1 mol·L-1Tris?HC1（pH值8.0）10 m L、0.5 mol·L-1EDTA（pH值8.0）4 mL、5 mol· L-1NaCl28 mL、50%PVP10 mL、10×CTAB抽提液20 mL、100%β?巰基乙醇2 mL、超純水26 mL混勻備用（100 mL）。

1.3.11 高鹽2×CTAB提取緩沖液（現用現配）

將1 mol·L-1Tris?HCl（pH值8.0）10 m L、0.5 mol·L-1EDTA（pH值8.0）4 mL、5 mol· L-1NaCl 40 m L、50%PVP 10 m L、10×CTAB抽提液20 mL、100%β?巰基乙醇2 mL、超純水14 mL混勻備用（100 mL）。

1.3.12 TE緩沖液（pH值8.0）

將1 mol·L-1Tris?HCl（pH值8.0）2.0 m L、0.5 mol·L-1EDTA（pH值8.0）0.4 mL、超純水197.6 m L混合，調溶液pH值至8.0，分裝后高壓滅菌，4℃保存備用（100 m L）。

1.3.13 5×TBE（Tris?硼酸）電泳緩沖液

稱27 g Tris堿，13.75 g硼酸，加入0.5 mol· L-1EDTA（pH值8.0）10 mL，蒸餾水350 mL，攪拌溶解后，定容至500 mL。瓊脂糖凝膠電泳時使用液為0.5×TBE，取配制的5×TBE 500 mL加水定容至5 L即可。

1.4 DNA提取方法

1.4.1 SDS法

稱取0.2 g樣本用液氮研磨成粉，加入lmL提取液（500 mmol·L-1NaCl，50 mmol·L-1Tris?HCl pH值8.0，50 mmol·L-1EDTA，2%β?巰基乙醇）室溫數分鐘解凍后，加入0.5 mL10%SDS溶液，輕輕混勻，于65℃保溫30 min；取出后立即置于冰上，加0.24 mL 5 mol·L-1KAc溶液于冰上反應30 min；10 000 r·min-1，4℃離心20 min；取上清液加1倍體積的無水乙醇，-20℃放置30 min；10 000 r·min-1，4℃離心20 min；用0.5 mL TE緩沖液溶解沉淀，加等體積的氯仿?異戊醇（24∶1），混勻；10 000 r·min-1，4℃離心10 min；取上清液加0.8倍體積-20℃預冷的異丙醇和1／10體積的3 mol·L-1NaCl，-20℃靜置30 min沉淀DNA；10 000 r·min-1，4℃離心20 min；70%的乙醇洗滌DNA沉淀2次，風干后溶于100μL TE緩沖液，4℃保存備用。

1.4.2 傳統CTAB法

取0.2 g植物材料，雙蒸水洗凈，并用濾紙吸干；植物材料剪成1 cm左右碎片，放入預冷的瓷研缽中。加入液氮速冷，研磨成細粉（越細越好）；在5 mL離心管中加入抽提緩沖液1 m L，65℃保溫1 h；15 000 r·min-1，離心10 min；上清液轉入另一個新的離心管中；加入等體積氯仿∶異戊醇（24∶1），混勻抽提至水乳膠融狀；15 000 r·min-1，離心10 min；上清液轉入另一個新的離心管中；加入1倍體積預冷無水乙醇，-20℃保溫30～60 min，緩緩混勻DNA成絮狀析出；15 000 r·min-1，離心10 min，棄上清；DNA沉淀用70%乙醇洗2次；加入100μL TE buffer溶解DNA。

1.4.3 高鹽CTAB法

取0.2 g植物材料，雙蒸水洗凈，并用濾紙吸干；植物材料剪成1 cm左右碎片，放入預冷的瓷研缽中；加入液氮速冷，研磨成細粉（越細越好）；在5 mL離心管中加入抽提緩沖液1 mL，65℃保溫1 h；15 000 r·min-1，離心10 min。上清轉入另一個新的離心管中∶加入等體積氯仿：異戊醇（24∶1），混勻抽提至水乳膠融狀；15 000 r·min-1，離心10 min；上清液轉入另一個新的離心管中；加入1倍體積預冷無水乙醇，-20℃保溫30～60 min，緩緩混勻DNA成絮狀析出；15 000 r·min-1，離心10 min，棄上清；DNA沉淀用70%乙醇洗2次；加入100μL TE buffer溶解DNA。

1.5 DNA提取質量的檢測

1.5.1 瓊脂糖凝膠電泳的檢測

將不同方法提取所得的DNA溶液各取5μL，與1μL載樣緩沖液（LB）混勻后，在0.8%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳緩沖液為0.5×TBE液，電壓為80 V。待混合液藍色條帶遷移適當距離（一般為距加樣孔3～5 cm處）時停止電泳，取出凝膠，將凝膠小心放入事先配好的EB溶液（濃度為0.5μg·mL-1）中浸泡染色30～50 min，在凝膠成像系統中觀察并照相［2］。

1.5.2 紫外分光光度計檢測

利用紫外分光光度計檢測3種方法對商洛野生蕙蘭葉片基因組DNA的吸光度（D）的測定，并分析其濃度和純度。TE緩沖液作為空白對照，按儀器的使用說明進行操作，D值為5次測量后的平均值。

根據D260＝1時，dsDNA濃度約為50μg· mL-1，DNA濃度／（μg·mL-1）＝D260×50μg· m L-1×稀釋倍數。根據D260／D280比值評價核酸純度，當D260／D280數值大于2.0時，表示有RNA的污染；數值小于1.8時，表示有蛋白質污染；數值為1.8～2.0時，表示提取的DNA的純度較高。DNA提取率提取率／（μg·g-1）＝DNA濃度×體積／樣重。

2 結果與分析

2.1 3種方法所提取DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測

采用SDS、CTAB和高鹽CTAB法提取商洛野生蕙蘭基因組DNA，并進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳后的凝膠成像圖譜（圖1）。

圖1 不同方法提取DNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜

從3種方法所提取DNA跑出條帶分析，均出現了圖譜模糊亮帶及拖尾現象。所以，3種方法所提取基因組DNA完整性較差，通過電泳圖譜很難判斷提取效果優劣。幾種方法所得電泳條帶均有拖尾現象，原因可能是DNA提取所用材料在儲存和操作過程中產生了組織DNA的部分降解。

2.2 3種方法所提DNA紫外分光光度計檢測

對3種方法所提DNA分別進行吸光度檢測（表1），采用SDS、CTAB和高鹽CTAB法測得D260／D280比值分別為1.583，1.672，1.967。其中高鹽CTAB法提取的DNA純度最高，而SDS和CTAB法的比值均小于1.8，說明有一定的蛋白質污染。

表1 不同方法所提DNA紫外分光光度計檢測結果

從表中可以看出，高鹽CTAB法提取到DNA濃度和提取率最高，其次為CTAB法，SDS法最小，依次初步判定這3種方法提取的DNA效果為，高鹽CTAB法最佳，CTAB法次之，SDS法相對較差。

3 小結與討論

以商洛野生蕙蘭幼嫩葉片為材料，通過SDS、CTAB和高鹽CTAB法提取基因組DNA。高鹽CTAB法獲得DNA產量高、質量好，但方法還有待完善。

PVP是一種酚的絡合物，同時含有親水基團和親油基團，較易溶解于極性較強的有機溶劑，可有效去除酚類物質。本研究在提取緩沖液中加入適量的PVP，有效去除了產物中的酚類物質。

基因組DNA的降解對試驗結果有一定影響，降解的原因有很多，如外界物理因素（溫度、濕度）、化學因素（pH值、水解反應、氧化反應）和生物因素（酶解及微生物侵染）等。推測基因組DNA不同程度的降解，可能由于蕙蘭葉片老化且木質化程度較高而導致組織研磨困難或操作時間過長造成。為得到盡可能完整的基因組DNA，在今后研究中應盡量簡化操作步驟；提取過程應溫和操作，避免劇烈震蕩，用剪去尖端的槍頭吸取上清液，吸取過程避免產生氣泡，不要反復吸打助溶DNA；干燥DNA沉淀時，應注意沉淀的干燥程度，太干會導致沉淀不易重懸。另外，提取植物基因組DNA時要用氯仿?異戊醇抽提幾次，抽提次數不夠會導致蛋白等雜質過多，但抽提次數過多則會丟失部分DNA。對于蕙蘭基因組DNA提取方法的具體優化還有待研究。

［1］ 謝偉，超銀，郭政宏，等.蘭花基因組DNA多態性RAPD分析［J］.湖北農業科學，2006，45（1）：24-26.

［2］ 任衍春，張震，毛雪琴，等.水稻紋枯菌總DNA提取方法的比較［J］.浙江農業學報，2011，23（4）：741-747.

［3］ 劉陽，陳小強，孫寧，等.大花蕙蘭子房基因組DNA提取方法的比較研究［J］.天津農學院學報，2012，19（2）：14-18.

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［5］ 司更花，朱國鵬.五唇蘭基因組DNA提取方法的優化［J］.熱帶林業，2012，40（2）：37-39.

［6］ 王國鼎，文曉鵬，季祥彪.11種蘭屬植物DNA的提取及RAPD?PCR實驗體系的建立與優化［J］.種子，2007，26（3）：24-27.

（責任編輯：張瑞麟）

S 682.31 < class="emphasis_bold">文獻標志碼：A

A

0528?9017（2014）01?0073?03

文獻著錄格式：李小玲，華智銳.商洛野生蕙蘭基因組DNA提取方法的比較［J］.浙江農業科學，2014（1）：73-76.

2013?08?19

李小玲（1980-），女，陜西藍田人，講師，碩士，主要從事植物生物技術研究工作。E?mail：huazhirui2080＠21cn.com。