ZNT1在膀胱癌組織中的表達及臨床意義

荊宏偉 孔垂澤 張哲 郭坤峰

ZNT1在膀胱癌組織中的表達及臨床意義

荊宏偉 孔垂澤 張哲 郭坤峰

目的明確ZNT1在膀胱癌組織中表達情況，為進一步的研究奠定基礎。方法免疫組化檢測23例膀胱癌和9例正常膀胱組織中ZNT1的表達情況;利用Real-time RT-PCR和Western blot法檢測膀胱組織中ZNT1的mRNA和蛋白表達情況，檢測ZNT1在膀胱癌組織中mRNA和蛋白的表達情況，分析ZNT1基因表達的臨床意義。結果免疫組化檢測結果顯示ZNT1在正常膀胱組織中表達非常微弱，其陽性率為22.2%，而在膀胱癌組織中其陽性率為87%，差異有統計學意義(P＜0.01)。Real Time RT-PCR及Western Blot結果均顯示ZNT1在膀胱癌組織中表達顯著升高，與其在正常膀胱組織中的表達量相比，差異有統計學意義(P＜0.01)。結論ZNT1在mRNA及蛋白水平，在膀胱癌中的表達含量與其在正常膀胱組織的表達量相比均顯著升高，有可能成為膀胱癌的一個早期診斷指標。

膀胱腫瘤;ZNT1;鋅轉運體

膀胱癌是男性泌尿生殖系統常見的惡性腫瘤。在美國男性中，膀胱癌是第四位最常見的癌癥，是癌癥致死的第九大原因，男女患者的比例大約是 3∶1.1［1］。膀胱癌發生、發展的病理過程相當復雜，涉及到很多方面，對此人們也已展開廣泛的研究，關于微量元素及其相關蛋白在癌癥中的作用以及與膀胱癌發生發展的關系逐漸引起了人們的重視。目前研究表明在膀胱癌患者中，血鋅含量低于健康人群［2］，而尿鋅的含量明顯高于健康人群，說明在膀胱癌中鋅的代謝存在異常，在侵襲性膀胱癌中，尿鋅含量要高于淺表性膀胱癌和健康人群，同時研究也發現在膀胱癌發生的早期，組織的鋅已經開始下降，因而推測鋅的轉運在膀胱癌的發生發展中有可能起到很重要的作用。鋅轉運體(Zinc Transporter，ZnT)家族是新近發現的一類金屬離子轉運體，其主要功能是將鋅離子轉出細胞內，與其功能相反的是鋅鐵調控蛋白(ZRT，IRT-like protein，ZIP)家族，其主要是將鋅離子轉入細胞，兩者共同作用維持細胞內鋅離子的穩定。ZNT1屬于ZNT家族的一員，在鋅離子的吸收轉運中起到重要的作用，本試驗利用免疫組化檢測ZNT1在23例膀胱癌及9例膀胱正常黏膜中的表達情況，同時利用實時定量RT-PCR和Western Blot分別檢測62例膀胱癌及15例正常膀胱黏膜組織中ZNT1的RNA和蛋白表達情況，揭示其與膀胱癌臨床分期及病理分級之間的關系，為進一步闡明ZNT1在膀胱癌發生發展中的機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 膀胱組織蠟塊均來自2010年12月至2012年12月中國醫科大學附屬第一醫院泌尿外科住院病例。其中膀胱癌患者23例，年齡32～75歲，平均年齡48.7歲。病理分類均為膀胱移行細胞癌(TCCB)，按照WHO(1973)膀胱移行細胞癌分級標準分級:G1級11例、G2級9例、G3級3例。膀胱癌2009 TNM分期系統(UICC):Ta 15例、T1 4例、T2 1例、T3 2例、T4 1例。62例膀胱癌及15例癌旁正常膀胱新鮮組織標本均為2011年3月至2012年11月于中國醫科大學附屬第一醫院泌尿外科住院并接受手術治療的原發性膀胱尿路上皮癌患者的新鮮膀胱癌組織和癌旁正常組織，所有標本均得到患者授權，所有患者均為初發，復發性膀胱腫瘤和手術前曾接受放療或化療的患者標本剔除本研究。癌旁組織距離腫瘤邊緣大于2 cm。所有患者在行膀胱部分切除或全切后留取標本于Trazol中－80℃保存，當日或次日提取總RNA和總蛋白。62膀胱癌患者年齡29～70歲，平均年齡43.4歲，入院均行經血尿生化、泌尿系直腸超聲、膀胱CT或CTU檢查。病理分類均為膀胱移行細胞癌(TCCB)，按照WHO(1973)膀胱移行細胞癌分級標準分級:G1級45例、G2級11例、G3級6例。膀胱癌2009 TNM分期系統(UICC):Ta 26例、T1 17例、T2 11例、T3 5例、T4 3例。腫瘤組織標本獲得方式:經尿道膀胱腫瘤切除術42例，膀胱部分切除術9例，膀胱全切術11例。

1.2 主要試劑及溶液配制 兔抗人ZNT1克隆抗體購自美國Abcam公司;鼠抗人GAPDH多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司;S-P免疫組化試劑盒、DAB顯色劑、枸櫞酸抗原修復緩沖液0.01 mol/L，pH值6.0、PBS緩沖液:0.01 mol/L，pH 值7.2 ～7.4 均購自北京中杉金橋生物技術有限公司;TRIzol購自美國Invitrogen公司;SYBR?PrimeScriptTM RT-PCR KitⅡ(Perfect Real Time)試劑盒購自大連Takara公司;上下游引物均由大連寶生物工程有限公司(Takara)設計合成。

1.3 試驗方法

1.3.1 免疫組化(SP法):免疫組化結果判定免疫組化結果判定方法:ZNT1定位于細胞膜，胞膜出現淺黃色至棕褐色顆粒為陽性細胞。采用陽性染色強度結合陽性細胞所占百分數進行判斷。染色強度分數標準:無色為0分;淺黃色為1分;棕黃色為2分;棕褐色為3分。高倍鏡下每張切片隨機觀察4個視野計數陽性細胞數，1% ～10%為1分;11% ～50%為2分，51% ～75%為3分;﹥75%為4分。兩項得分相乘，滿3分為“+”;4分為“++”;5分以上為“+++”，“+ ～ +++”為陽性表達。

1.3.2 Real-Time RT PCR:①引物:ZNT1上游引物:5’-TACCAFCAACTCCAACGG-3’;ZNT1 下游引物:5’-GAACCCAAGGCATCTCCA-3’;β-actin 上游引物:5’-TGGCACCC AGCAC A A TGAA-3’;β-actin 下游引物:5’-CTAAGTCATAGTCCGCC TAGAA GCA-3’;②組織RNA提取;③逆轉錄反應;④實時定量PCR反應本實驗采用SYBRGreen嵌合熒光進行反應，按說明書配置25 μl反應體系。

1.3.3 Western Blot:①組織蛋白提取;②蛋白濃度測定(BCA蛋白定量檢測試劑盒);③SDS-PAGE電泳;④轉膜;⑤ZNT1蛋白的免疫學檢測應用Chemi Image 5500凝膠成像系統成像，應用Image J分析條帶灰度。

1.4 統計學分析 計數資料采用 χ2檢驗，P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化 免疫組化檢測結果顯示ZNT1定位于膀胱癌細胞胞漿內，其在膀胱癌組織中表達明顯，其陽性表達率為87.0%(20/23)，而在癌旁正常膀胱組織中表達非常微弱，其陽性率為22.2%(2/9)，差異有統計學意義(χ2=9.784，P ＜0.01)。見圖 1。

圖1 ZNT1在膀胱癌及正常膀胱組織中的表達

2.2 Western Blot ZNT1在膀胱癌組織中的蛋白表達含量與其在正常膀胱黏膜組織中的表達含量相比亦明顯升高，與免疫組化結果及ZNT1 mRNA的變化趨勢相一致，差異均有統計學意義(P＜0.05)。見圖2。

圖2 ZNT1蛋白在膀胱癌及正常膀胱組織中的表達

2.3 Real Time RT-PCR ZNT1在62例膀胱癌組織中ZNT1的mRNA表達含量與其在15例正常膀胱黏膜組織中的表達含量相比，ZNT1的表達含量顯著升高，ZNT1 mRNA在膀胱癌組織中的平均表達含量為正常膀胱黏膜組織中的6.6倍，其差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖3、4。

圖3 ZNT1 mRNA在膀胱癌及正常膀胱組織中的表達

圖4 ZNT1在膀胱癌及正常膀胱組織中的擴增曲線和溶解曲線(A＆B:ZNT1在膀胱癌及正常膀胱組織中的擴展曲線和溶解曲線;C＆D:β-actin在膀胱癌及正常膀胱組織中的擴增曲線和溶解曲線)

3 討論

鋅是機體組織和細胞內必需的微量元素，其參與體內多種蛋白質、核酸的合成和分解代謝酶的活性和構成，鋅缺乏會導致機體發育遲緩，DNA合成修復受損，免疫功能缺陷等一系列疾病［3］。在膀胱癌患者中，血鋅含量低于健康人群［4］，而尿鋅的含量明顯高淺表性膀胱癌細胞的凋亡影響更明顯，推測鋅與膀胱癌的發生發展可能有很大的關系，因而對鋅及與其相關的蛋白都成為研究的熱點［5］。

新近發現的鋅轉運體(Zinc Transporter，ZnT)家族是一類金屬離子轉運體，其主要功能是將鋅離子轉出細胞，與其功能相反的是鋅轉運體(Zinc Transporter，ZnT)家族，其主要是將鋅離子轉入細胞內，兩者共同作用維持細胞內鋅離子的穩定。目前研究顯示鋅轉運體與許多惡性腫瘤的進展有關，其在乳腺癌和胰腺癌進展中作用已經得到部分證實［6，7］。ZnT1是ZnT家族中最先被發現的鋅轉運體，在組織器官分布方面，鋅轉運蛋白1也表現出特殊規律，其主要分布在小腸上皮細胞、腎臟上皮細胞、肝細胞及胰腺腺細胞等，有研究表明 Cd2+、Cu2+、Mg2+、Na+、K+、Cl－等，對 ZnT1 的鋅外排作用幾乎無影響［8］，說明ZnT1對鋅的外排不受這些離子的干擾，是專一性的鋅轉運體。

本研究首次應用免疫組化，Real Time RT-PCR及Western Blot在蛋白及mRNA水平上檢測ZNT1在膀胱癌及癌旁正常膀胱表達差異。免疫組化染色顯示ZNT1在膀胱癌組織中具有很高的陽性表達率(87.0%)，而在癌旁正常膀胱組織中表達含量很低，其陽性率僅為22.2%，其組織間表達差異具有顯著統計學意義，Western Blot檢測亦顯示ZNT1在膀胱癌組織中具有更高的表達。實時定量RT-PCR檢測結果顯示ZNT1 mRNA在膀胱癌中的表達含量與其在癌旁正常膀胱組織中的表達量相比升高顯著，其差異具有統計學意義(P ＜0.01)，ZNT1 mRNA在膀胱癌組織中的平均表達含量為癌旁正常膀胱組織中的6.6倍。我們的研究結果顯示在mRNA和蛋白水平上，ZNT1在膀胱癌組織中的表達均明顯升高，表明其有可能成為膀胱癌早期診斷的一個良好指標。

總之，通過本研究我們認為ZNT1在膀胱癌組織中的表達明顯升高，ZNT1可作為膀胱癌的一個早期診斷指標，其在膀胱癌的發生發展中可能扮有很重要的作用，這也為我們后續研究奠定了良好的基礎，隨著研究的不斷深入它有可能成為膀胱癌治療的一個重要靶點。

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2 Kagara N，Tanaka N，Noguchi S，et al.Zinc and its transporter ZIP10 are involved in invasive behavior of breast cancer cells.Cancer Sci，2007，98:692-697.

3 Krebs NF.Overview of zinc absorption and excretion in the human gastrointestinal tract.J Nutr，2000，130:1374-1377.

4 Huang L，Tepaamorndech S.The SLC30 family of zinc transporters-A review of current understanding of their biological and pathophysiological roles.Mol Aspects Med，2013，34:548-560.

5 Mazdak H，Yazdekhasti F，Movahedian A，et al.The comparative study of serum iron，copper，and zinc levels between bladder cancer patients and a control group.Int Urol Nephrol，2010，42:89-93.

6 Li M，Zhang Y，Liu Z，et al.Aberrant expressionof zinc transporter ZIP4(SLC39A4)significantly contributes to human pancreatic cancer pathogenesis and progression.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104:18636-18641.

7 Desouki MM，Geradts J，Milon B，et al.hZip2 and hZip3 zinc transporters are down regulated in human prostate adenocarcinomatous glands.Mol Cancer，2007，6:37.

8 Wang K，Zhou B，Kuo YM，et al.A novel member of a zinc transporter family is defective in acrodermatitis enteropathica.Am J Hum Genet，2002，71:66-73.

Expression and clinical significance of zinc transporter ZNT1 in bladder carcinoma

JING Hongwei，KONG Chuize，ZHANG Zhe，et al.Department of Urology，The First Affiliated Hospital of China Medical University，Shenyang 110001，China

ObjectiveTo detect the expression levels of zinc transporter(ZNT1)in normal bladder mucosal tissue and bladder carcinoma tissues in order to provide scientific data for further study.MethodsImmunohistochemistry was used to detect the expression levels of ZNT1 in 23 cases of bladder cancer tissue and 9 cases of normal bladder tissue.Real Time RT-PCR and Western Blot were used to detect the mRNA and protein levels of ZNT1 in bladder carcinoma and normal bladder mucosal tissue so as to analyze the clinical significance of ZNT1 gene expression.ResultsThe immunohistochemical results showed that the expression levels of ZNT1 in normal bladder tissue were relatively lower，with the expression positive rate being 22.2%，however，which in bladder cancer tissue was 87%，there were significant differences between normal bladder tissue and bladder cancer tissue(P ＜ 0.01).Both the Real Time RT-PCR and Western Blot analysis results showed that the expression levels of ZNT1 in normal bladder tissue were significantly increased，as compared with those in normal bladder tissues(P ＜0.01).ConclusionThe expression levels of ZNT1 mRNA and protein in bladder cancer tissue are obviously increased，as compared with those in normal bladder tissue，which may be one of indexes in the early diagnosis of bladder cancer.

bladder cancer;ZNT1;zinc transporter

R 737.14

A

1002－7386(2014)09－1285－04

10.3969/j.issn.1002 －7386.2014.09.001

項目來源:高等學校博士學科點專項(博導類)(編號:20112104110006)

110001 沈陽市，中國醫科大學第一附屬醫院泌尿外科

孔垂澤，110001 中國醫科大學第一附屬醫院泌尿外科;

E-mail:jhw_david@sina.com

2013－10－13)