蛋清肽的制備及其對保加利亞乳桿菌促生長的作用

任 靜，孫 波*，趙 曉，孫欣瑤，齊 玉，李海鑫，樊 慶，孫 盛

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

蛋清肽的制備及其對保加利亞乳桿菌促生長的作用

任 靜，孫 波*，趙 曉，孫欣瑤，齊 玉，李海鑫，樊 慶，孫 盛

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

研究Alcalase堿性蛋白酶酶解蛋清制備蛋清肽和蛋清肽對保加利亞乳桿菌生長的影響。結(jié)果表明：通過Box-Behnken設(shè)計確定酶解的最佳工藝為：底物質(zhì)量濃度4.5 g/100 mL、酶解pH 9.0、酶解溫度64℃、加酶量（[E]/[S]）5.0%，此條件下，酶解3 h后水解度達(dá)21.89%。蛋清肽可顯著促進(jìn)保加利亞乳桿菌生長，當(dāng)添加體積分?jǐn)?shù)3.0%、酶解3 h的蛋清肽（分子質(zhì)量主要集中在1 513 u）時，其促生長效果最好，此時，與未添加蛋清肽組相比，活菌數(shù)提高了1（lg（CFU/mL））。

蛋清肽；保加利亞乳桿菌；促生長

保加利亞乳桿菌作為我國衛(wèi)生部列出的9類益生菌之一，其在食品、醫(yī)療保健等領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣[1-3]。然而，國際和國內(nèi)規(guī)定中聲明，益生菌活菌數(shù)不得少于106CFU/mL或106CFU/g，否則不能產(chǎn)生渴望的健康訴求[4]，因此，如何促進(jìn)保加利亞乳桿菌快速生長、提高保加利亞乳桿 菌的活菌數(shù)量則成為大規(guī)模酶制劑生產(chǎn)中的一項(xiàng)重要任務(wù)。

蛋清肽是蛋清經(jīng)蛋白酶適度水解生成的多肽混合物，蛋清中含有豐富的蛋白質(zhì)和人體必需的多種氨基酸，且氨基酸組成配比均衡性好，是營養(yǎng)學(xué)界公認(rèn)的機(jī)體利用率最高、最優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)[5-6]。水解后的蛋清肽不僅分子質(zhì)量小，利于吸收，且許多具有獨(dú)特序列的肽還具有特殊的生理功效[7-11]。近年來，國內(nèi)外已有相關(guān)研究報道乳蛋白、綠豆蛋白、大豆蛋白、酪蛋白、魚蛋白來源的肽具有不同程度促進(jìn)乳酸菌生長的影響[12-18]，然而，有關(guān)蛋清肽對乳酸菌生長的影響鮮見報道。

本實(shí)驗(yàn)以雞蛋蛋清為原料，采用Alcalase堿性蛋白酶酶解制備蛋清肽，利用Box-Behnken響應(yīng)面分析法優(yōu)化蛋清肽制備工藝，并進(jìn)一步探討蛋清肽對保加利亞乳桿菌生長的影響，旨在為提高保加利亞乳桿菌的活菌數(shù)量、促進(jìn)蛋清肽在乳制品生產(chǎn)中的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋 市售。

Alcalase堿性蛋白酶（24萬U/mL） 諾維信生物制品有限公司；Sephadex G-25 美國Pharmacia公司。

1.2 菌種與培養(yǎng)基

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus） 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院保藏。

MRS培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10.0、葡萄糖20.0、牛肉膏10.0、酵母膏5.0、無水乙酸鈉5.0、檸檬酸二銨2.0、硫酸鎂0.58、硫酸錳0.28、瓊脂15.0、吐溫-80 1.0 mL/L，pH 6.2～6.4，121 ℃滅菌15 min。

1.3 儀器與設(shè)備

HYP-Ⅱ型消化爐 上海纖檢儀器有限公司；JJ-1型電動攪拌器 常州國華電器有限公司；HD-1型核酸蛋白檢測儀 金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司；PHS-3C型精密pH計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；CJ-2D型超凈工作臺 天津泰斯特儀器有限公司；TDZ4低速離心機(jī)上海平凡儀器儀表有限公司；DHP-9162恒溫培養(yǎng)箱、HWS-24電熱恒溫水浴鍋 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；722可見分光光度計 天津市普瑞斯儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 蛋清肽的制備

稱取一定量攪打后的雞蛋蛋清，加水稀釋至一定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度后，沸水浴加熱處理15 min，加入Alcalase堿性蛋白酶酶解，酶解后95 ℃保溫10 min滅酶，冷卻，4 000 r/min離心30 min，上清液即為蛋清肽。

1.4.2 水解度的測定

采用茚三酮比色法[19]測定。

1.4.3 蛋清肽分子質(zhì)量測定

采用凝膠柱層析法測定蛋清肽的分子質(zhì)量分布。層析條件為：Sephadex G-25柱（2.6 cm×50 cm），流速1.0 mL/min，0.1 mol/L pH 7.0磷酸緩沖液洗脫；溫度23 ℃；檢測波長280 nm。

取苯丙氨酸（Mw=168 u）、還原型谷胱甘肽（Mw=307 u）、氧化型谷胱甘肽（Mw=612 u）、桿菌肽（Mw=1 422 u）、溶菌酶（Mw=14 000 u）各10 mg，分別溶于1 mL洗脫液中，制成標(biāo)準(zhǔn)溶液。將處理好的交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex G-25）裝柱，按照上述條件操作，用記錄儀記錄流出液吸收情況。洗脫液洗脫至基線平穩(wěn)，加入標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品0.2 mL，用量筒記錄最大吸收峰出現(xiàn)時洗脫液流出體積。

1.4.4 保加利亞乳桿菌活菌數(shù)測定

參照GB/T 4789.35—2010《食品微生物檢驗(yàn) 食品中乳酸菌檢驗(yàn)》方法測定。

1.4.5 滴定酸度測定

參照GB 5413.34—2010《乳和乳制品酸度的測定》方法測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋清肽酶解工藝條件的優(yōu)化

2.1.1 酶解pH值對水解度的影響

pH值是酶促反應(yīng)的重要參數(shù)，其過高或過低均會抑制酶的活性，進(jìn)而降低反應(yīng)速率。底物質(zhì) 量濃度4.0 g/100 mL、酶解溫度60 ℃、加酶量（[E]/[S]）4.0%、酶解3 h，研究pH值對蛋清肽水解度的影響，結(jié)果如圖1所示，pH值以9.0為宜。

圖1 酶解pH值對蛋清肽水解度的影響Fig.1 Effect of pH on the degree of hydrolysis

2.1.2 酶解溫度對水解度的影響

底物質(zhì)量濃度4.0 g/100 mL、加酶量4.0%、酶解pH 9.0、酶解3 h，研究酶解溫度對蛋清肽水解度的影響，結(jié)果如圖2所示，當(dāng)溫度低于65 ℃時，隨著酶解溫度的升高，水解度也隨之增加，但當(dāng)酶解溫度大于65 ℃時，隨著酶解溫度的升高，水解度顯著下降，可見，過高的溫度破壞了酶的活性中心，改變了酶的構(gòu)象，進(jìn)而導(dǎo)致酶切作用迅速降低，因此，本實(shí)驗(yàn)中，溫度以65 ℃為宜。

圖2 酶解溫度對蛋清肽水解度的影響Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on the degree of hydrolysis

2.1.3 底物質(zhì)量濃度對水解度的影響

圖3 底物質(zhì)量濃度對蛋清肽水解度的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on the degree of hydrolysis

底物質(zhì)量濃度過高，加熱變性后蛋白凝固而形成凝膠狀，不利于酶的作用；底物質(zhì)量濃度過低，又會降低生產(chǎn)效率。加酶量4.0%、酶解pH 9.0、酶解溫度65 ℃、酶解3 h，研究底物質(zhì)量濃度對蛋清肽水解度的影響，結(jié)果如圖3所示，底物質(zhì)量濃度以4.5 g/100 mL為宜。

2.1.4 加酶量對水解度的影響

加酶量越大，其與底物蛋白接觸的幾率越大，水解度也會隨之增加，但加酶量過大則會造成資源浪費(fèi)，成本增加。底物質(zhì)量濃度4.5 g/100 mL、酶解pH 9.0、酶解溫度65 ℃、酶解3 h，研究加酶量對蛋清肽水解度的影響，結(jié)果如圖4所示，加酶量以6.0%為宜。

圖4 加酶量對蛋清肽水解度的影響Fig.4 Effect of enzyme concentration on the degree of hydrolysis

2.1.5 響應(yīng)面法優(yōu)化蛋清肽酶解工藝

表1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 1 Experiment design and results for response surface analysis

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取蛋清肽酶解工藝中的4個因素，即酶解pH值、酶解溫度、底物質(zhì)量濃度、加酶量為自變量，分別用x1、x2、x3、x4表示，以水解度Y為響應(yīng)值，采用Design-Expert 7.0軟件中的Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計原理設(shè)計響應(yīng)面分析試驗(yàn)，其結(jié)果見表1。

通過統(tǒng)計分析軟件Design-Expert 7.0對表1中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得二元回歸方程為：

Y=21.06－0.037x1－0.42x2－0.23x3－2.10x4－0.71x1x2＋0.12x1x3＋0.25x1x4－0.50x2x3＋0.19x2x4－0.035 x3x4－2.23x12－1.20x22－1.59x32－1.38x42

表2 模型方差分析Table 2 Analysis of variance for the response surface regression model

對模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2，方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯，該模型顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著，且該模型相關(guān)系數(shù)R2=99.81%，校正決定系數(shù)表明該模型與實(shí)驗(yàn)擬合良好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，可用于該反應(yīng)的理論推測。由F檢驗(yàn)得各因子的貢獻(xiàn)率依次為：x4＞x2＞x3＞x1，即加酶量＞酶解溫度＞底物質(zhì)量濃度＞酶解pH值。由顯著性分析可知，x2、x3、x4、x1x2、x1x4、x2x3、x2x4、x12、x22、項(xiàng)達(dá)到了極顯著的水平。

圖5 各因素兩兩相互作用對蛋清肽水解度影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots for the pairwise effects of four process conditions on the degree of hydrolysis of egg white

由圖5各因素對蛋清肽水解度影響的響應(yīng)面和等高線圖可知，酶解pH值和酶解溫度、酶解pH值和加酶量、酶解溫度和底物質(zhì)量濃度、酶解溫度和加酶量之間交互作用顯著。

2.1.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

應(yīng)用響應(yīng)面法對回歸模型進(jìn)行分析，確定蛋清肽酶解的最佳工藝條件為：酶解pH 8.99、酶解溫度63.87 ℃、底物質(zhì)量濃度4.49 g/100 mL、加酶量5.22%；綜合考慮實(shí)際可操作性，將蛋清肽酶解的最佳工藝條件修整為：酶解pH 9.0、酶解溫度64 ℃、底物質(zhì)量濃度4.5 g/100 mL、加酶量5.0%。在最優(yōu)條件下對響應(yīng)面法優(yōu)化的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，3次平行實(shí)驗(yàn)水解度的平均值為21.89%，接近Design Expert 7.0軟件得到的預(yù)測值21.93%，由此證明此響應(yīng)面試驗(yàn)參數(shù)準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ胶侠怼?/p>

2.1.7 蛋清肽分子質(zhì)量的測定結(jié)果

一定分子質(zhì)量的物質(zhì)通過葡聚糖凝膠柱的時間或洗脫體積與分子質(zhì)量的對數(shù)呈線性關(guān)系，分子質(zhì)量越大，其通過凝膠柱的時間越短，洗脫體積越小[20]。按照1.4.3節(jié)所述的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以各標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量對數(shù)為橫坐標(biāo)（x），洗脫體積為縱坐標(biāo)（y）繪制分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為y=－34.01x＋185.6（R2= 0.998 7），表明二者線性關(guān)系良好，可以用于分子質(zhì)量的測定。

表3 不同酶解時間下蛋清肽的出峰體積及分子質(zhì)量Table 3 Elution volumes and molecular weights of egg white peptides at different time points of hydrolysis

如表3和圖6所示，未水解的蛋清肽的出峰體積較小，為44 mL，其分子質(zhì)量較大，為14 454 u；隨著酶解時間的延長，洗脫體積在44 mL處峰高越來越小，且最高峰逐漸后移，表明高分子質(zhì)量蛋白逐漸被水解，分子質(zhì)量逐漸變小；當(dāng)酶解時間大于3 h時，隨著酶解時間的延長，其最高峰處的洗脫體積變化不大，最高峰的洗脫體積在77～78 mL之間，分子質(zhì)量在1 513～1 445 u。

2.2 蛋清肽對保加利亞乳桿菌生長的影響

2.2.1 蛋清肽分子質(zhì)量對保加利亞乳桿菌生長的影響

圖7 酶解時間對保加利亞乳桿菌生長的影響Fig.7 Effect of egg white peptides at different time points of hydrolysis on the growth of Lactobacillus bulgaricus

肽功能性與分子質(zhì)量密切相關(guān)[21]。本實(shí)驗(yàn)將已活化的保加利亞乳桿菌按體積分?jǐn)?shù)3%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，并分別加入1%最佳酶解工藝條件下不同酶解時間（0、1、2、3、4 h）的蛋清肽，同時以乙酸銨（無機(jī)氮源）作為對照組，使各組培養(yǎng)基的含氮量相同，37 ℃培養(yǎng)24 h后測定各組發(fā)酵液的活菌數(shù)及滴定酸度，以此來初步研究蛋清肽分子質(zhì)量對保加利亞乳桿菌生長的影響。由圖6、7可知，蛋清肽可顯著促進(jìn)保加利亞乳桿菌的生長，且隨著酶解時間的延長，小分子質(zhì)量肽段逐漸增多，其對保加利亞乳桿菌的促生長作用逐漸增強(qiáng)，但當(dāng)酶解時間大于3 h時，小分子質(zhì)量肽段含量幾乎不變，其促生長作用也增加緩慢，可見，肽分子質(zhì)量越小，其促生長作用越強(qiáng)，這與Lucas等[13]的研究結(jié)果一致。針對本實(shí)驗(yàn)蛋清肽促生長作用而言，蛋清肽的酶解時間以3 h為宜，此條件下制得的蛋清肽主要為分子質(zhì)量集中于1 513 u的肽段（表3）。

2.2.2 蛋清肽添加量對保加利亞乳桿菌生長的影響

圖8 蛋清肽添加量對保加利亞乳桿菌生長的影響Fig.8 Effect of egg white peptide concentration on the growth of Lactobacillus bulgaricus

本實(shí)驗(yàn)在保加利亞乳桿菌接種量為3%的MRS液體培養(yǎng)基中，分別加入1%、2%、3%、4%、5%最佳酶解工藝條件下酶解3 h的蛋清肽，以未添加蛋清肽作為對照，37 ℃培養(yǎng)24 h后，分別測定各組發(fā)酵液中的活菌數(shù)及滴定酸度，結(jié)果如圖8所示，蛋清肽的添加量顯著影響保加利亞乳桿菌的生長。當(dāng)?shù)扒咫奶砑恿繛?.0%～3.0%時，隨著添加量的增加，保加利亞乳桿菌的活菌數(shù)及滴定酸度增加；當(dāng)?shù)扒咫奶砑恿繛?.0%時，保加利亞乳桿菌的活菌數(shù)最多，為5.0×108CFU/mL，與對照組（2.8×107CFU/mL）相比，增加了一個數(shù)量級，這可能與添加蛋清肽增加了發(fā)酵液中肽和氨基酸的含量，提高乳酸菌生長所需的較理想的氮源密切相關(guān)；當(dāng)?shù)扒咫奶砑恿看笥?.0%時，隨著添加量增加，保加利亞乳桿菌活菌數(shù)及滴定酸度逐漸降低，促生長作用逐漸減小；但當(dāng)添加量為5.0%時，其對保加利亞乳桿菌生長具有抑制作用，這與胡志和等[16]的研究趨勢相同。可見，蛋清肽對保加利亞乳桿菌的促生長作用存在最適濃度范圍，并非添加量越大越好。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以雞蛋蛋清為原料，采用Alacase堿性蛋白酶酶解制備蛋清肽，確定其最佳制備工藝為：酶解pH 9.0、酶解溫度64 ℃、底物質(zhì)量濃度4.5 g/100 mL、加酶量5.0%。此條件下，酶解3 h后其水解度達(dá)21.89%。

研究了蛋清肽對保加利亞乳桿菌生長的影響，結(jié)果表明，蛋清肽可顯著促進(jìn)保加利亞乳桿菌生長，且隨著肽分子質(zhì)量的減小，其促生長作用越強(qiáng)；此外，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，蛋清肽對保加利亞乳桿菌的促生長作用存在最適濃度范圍，當(dāng)添加3.0%、酶解3 h的蛋清肽時（分子質(zhì)量主要集中在1 513 u），其對保加利亞乳桿菌的促生長作用最強(qiáng)，與未添加相比，可使活菌數(shù)提高一個數(shù)量級。

蛋清肽制備工藝簡單、操作方便，且廉價的蛋清肽可顯著促進(jìn)保加利亞乳桿菌生長，降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益，這不僅為保加利亞乳桿菌菌劑的大規(guī)模生產(chǎn)提供了一個新的途徑，同時也拓寬了蛋清肽的應(yīng)用領(lǐng)域，提高了雞蛋的附加值，其應(yīng)用前景廣闊。

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Preparation of Egg White Peptide and Its Growth-Promoting Activity for Lactobacillus bulgaricus

REN Jing, SUN Bo*, ZHAO Xiao, SUN Xin-yao, QI Yu, LI Hai-xin, FAN Qing, SUN Sheng
(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Egg white was hydrolyzed by Alcalase to prepare egg white peptide in this study. The optimal hydrolysis parameters were determined by Box-Behnken experimental design as 4.5 g/100 mL substrate concentration, pH 9.0, 64 ℃ and 5.0% [E]/[S] ratio, yielding a degree of hydrolysis as high as 21.89% in 3 h of hydrolysis. Egg white peptide could obviously promote the growth of Lactobacillus bulgaricus. The best growth-promoting effect was achieved by addition of 3.0% by volume of egg white hydrolyzed for 3 h (mostly peptides with a molecular weight of 1 513 u), increasing the number of viable cells by 1 (lg(CFU/mL)) when compared with the blank control.

egg white peptide; Lactobacillus bulgaricus; growth-promoting

TS201.3

A

1002-6630（2014）07-0170-06

10.7506/spkx1002-6630-201407034

2013-03-04

任靜（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c發(fā)酵工程。E-mail：renjing114@163.com

*通信作者：孫波（1962—），男，副教授，碩士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c發(fā)酵工程。E-mail：bosun114@163.com