耐超高壓脅迫副溶血性弧菌的逆境耐受性

黃小鳴，童 鈺，馬君妍，祝凱麗，周楊武，陸海霞,*，勵(lì)建榮

（1.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310035；2.渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州 121013）

耐超高壓脅迫副溶血性弧菌的逆境耐受性

黃小鳴1，童 鈺1，馬君妍1，祝凱麗1，周楊武1，陸海霞1,*，勵(lì)建榮2

（1.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310035；2.渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州 121013）

目的：探討水產(chǎn)品中耐超高壓脅迫的副溶血性弧菌對(duì)高壓及其他逆境環(huán)境的耐受性。方法：以80～250 MPa超高壓處理原始敏感菌株（Vibrio. parahaemolyticus ZJGSMC001），篩選得到耐高壓菌株（V. parahaemolyticus ZJGSPR001），以其他逆境處理，分析二者對(duì)高壓和其他逆境的耐受性差異。結(jié)果：以250 MPa壓力脅迫處理，耐壓菌株存活量比原始菌株高2（lg（CFU/mL））。3 ℃以下原始菌株生長(zhǎng)速率為負(fù)值，45 ℃以上原始菌株不能存活，耐壓菌株則生長(zhǎng)良好，1 ℃和48 ℃時(shí)仍可存活。在NaCl質(zhì)量濃度高達(dá)11.5 g/100 mL時(shí)，原始菌株為負(fù)生長(zhǎng)，耐壓菌株仍能生長(zhǎng)。耐壓菌株對(duì)有機(jī)溶劑和有機(jī)酸的耐受性增強(qiáng)，其中乙醇體積分?jǐn)?shù)12%、丙酮體積分?jǐn)?shù)9%、甲苯體積分?jǐn)?shù)0.75%、檸檬酸3 mg/mL和乳酸體積分?jǐn)?shù)1.5%時(shí)，原始菌株全部致死，耐壓菌株仍存活。結(jié)論：原始菌株對(duì)壓力較敏感，而耐壓菌株經(jīng)超高壓脅迫處理后，除對(duì)高壓的耐受能力提高外，對(duì)其他逆境（如溫度、氯化鈉、有機(jī)溶劑、有機(jī)酸）的耐受性也有所增強(qiáng)。

副溶血性弧菌；耐壓菌株；逆境

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VPH）是夏秋季沿海地區(qū)引發(fā)食物中毒的首要病原菌[1]。1950年，VPH首次在日本大阪引起食物中毒并暴發(fā)流行。副溶血弧菌主要通過(guò)烹飪不當(dāng)?shù)暮．a(chǎn)品、鹽腌制品或生熟不分所傳播，并引起食物中毒，還可引起淺表創(chuàng)傷感染、敗血癥等。副溶血弧菌的感染臨床癥狀為腹瀉、腸痙攣、惡心、嘔吐、發(fā)燒等典型胃腸炎反應(yīng)，嚴(yán)重者可引起敗血癥 。

隨著食品消費(fèi)市場(chǎng)需求的提高，人們?cè)絹?lái)越熱衷于制品的衛(wèi)生安全性、無(wú)添加劑性、營(yíng)養(yǎng)功能性、方便性、耐藏性及其色澤、風(fēng)味和外觀[2-4]，超高壓殺菌技術(shù)的出現(xiàn)正滿(mǎn)足了人們的需要。副溶血弧菌屬于耐壓性較弱的細(xì)菌，但在研究中發(fā)現(xiàn)有些副溶血性弧菌對(duì)超高壓有一定的耐受性[5]，在250 MPa以下超高壓處理之后少量細(xì)胞仍保持生命活力，而250 MPa以上壓力處理會(huì)對(duì)貝類(lèi)等鮮活水產(chǎn)品的品質(zhì)造成不利影響。

研究發(fā)現(xiàn)，在微生物受到亞致死劑量的預(yù)適應(yīng)處理后會(huì)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)[6]。不同的菌種，預(yù)適應(yīng)處理的差異、致死劑量的差異和生長(zhǎng)階段的差異都會(huì)產(chǎn)生不同的應(yīng)激反應(yīng)[7]。

為采取更有效的措施殺滅水產(chǎn)品中的副溶血性弧菌，尤其是能夠耐受逆境環(huán)境如高壓環(huán)境而存活下來(lái)的副溶血性弧菌，控制海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的污染率，本實(shí)驗(yàn)研究了副溶血弧菌原始菌株及其耐壓菌株對(duì)溫度、pH值、NaCl、有機(jī)溶劑（乙醇、丙酮、正丁醇、甲苯）、有機(jī)酸（檸檬酸、蘋(píng)果酸、酒石酸、乳酸）這些逆境環(huán)境的耐受性，以期通過(guò)在生產(chǎn)運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程適當(dāng)改變儲(chǔ)藏條件來(lái)徹底殺滅水產(chǎn)品中的副溶血弧菌，為有效殺滅水產(chǎn)品中耐超高壓致病菌提供思路，為超高壓技術(shù)在水產(chǎn)品保鮮殺菌和改善水產(chǎn)品品質(zhì)中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，ZJ GSMC001）由浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院提供，分離自水產(chǎn)品；氯化鈉胰蛋白胨大豆（TSA）瓊脂培養(yǎng)基和3 g/100 mL氯化鈉堿性蛋白胨水（APW）培養(yǎng)基杭州微生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PB.A2-600/0.6超高壓生物處理機(jī) 天津市華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司；MIR-554低溫恒溫培養(yǎng)箱 日本Sanyo公司；3-30K臺(tái)式高速離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；M200多功能酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司。

1.3 方法

1.3.1 耐壓菌的篩選

將活化好的副溶血弧菌5 000×g離心10 min，棄上清液，以無(wú)菌生理鹽水將菌懸液濃度調(diào)整至108CFU/mL，分裝于50 mL的無(wú)菌蒸煮袋中，熱封口。

采用80～250 MPa由低到高的超高壓多次處理副溶血性弧菌的方式來(lái)獲得可以耐受超高壓脅迫的副溶血弧菌菌株。壓力處理程序?yàn)?0、100、120、150、180、200、200、200、200、250、250、250 MPa的壓力依次處理15 min，對(duì)處理后的菌液進(jìn)行分離培養(yǎng)，從中分離得到最終存活下來(lái)的菌株。然后再對(duì)原始菌株和分離得到的菌株以0～500 MPa壓力分別處理15 min，若分離得到的菌株存活率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于原始菌株，即視其為耐高壓脅迫菌株。

1.3.2 副溶血弧菌與耐壓菌株耐受性差異研究[8]

1.3.2.1 溫度耐受性差異

將副溶血性弧菌和耐壓菌株接種于液體培養(yǎng)基中，200 r/min搖床培養(yǎng)12 h后，分別置于－1、1、2、3、4、5 ℃的低溫恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以及44、45、46、47、48、49 ℃的搖床中200 r/min培養(yǎng)24 h，隨后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，并計(jì)算生長(zhǎng)速率。

1.3.2.2 NaCl耐受性差異

將副溶血弧菌和耐壓菌株接種于液體培養(yǎng)基中，200 r/min搖床培養(yǎng)12 h后，分別置于NaCl質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/100 mL，以及10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5 g/100 mL的液體培養(yǎng)基中，200 r/min搖床中培養(yǎng)24 h，隨后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，并計(jì)算生長(zhǎng)速率。

1.3.2.3 pH值耐受性差異

將副溶血弧菌和耐壓菌株接種于液體培養(yǎng)基中，200 r/min搖床培養(yǎng)12 h后，調(diào)整液體培養(yǎng)基pH值至3.1、3.4、3.7、4.0、4.3、4.6、10.6、11.0、11.4、11.8、12.2、12.6，將副溶血弧菌和耐壓菌株分別置于200 r/min搖床中培養(yǎng)24 h，隨后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，并計(jì)算生長(zhǎng)速率。

1.3.2.4 有機(jī)溶劑耐受性差異

將副溶血弧菌和耐壓菌株分別接種于液體培養(yǎng)基中，200 r/min搖床培養(yǎng)12 h后，分別加入不等量的有機(jī)溶劑至不同的終體積分?jǐn)?shù)（乙醇6%、8%、10%、12%、14%；丙酮6%、7%、8%、9%、10%；正丁醇0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%、1.75%；甲苯0.05%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%），再次搖床培養(yǎng)2 h后平板計(jì)數(shù)測(cè)定菌落數(shù)。

1.3.2.5 有機(jī)酸耐受性差異

將副溶血弧菌和耐壓菌株分別接種于液體培養(yǎng)基中，200 r/min搖床培養(yǎng)12 h后，分別加入不等量的有機(jī)酸至不同的終質(zhì)量濃度或體積分?jǐn)?shù)（檸檬酸0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL；蘋(píng)果酸0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mg/mL；酒石酸0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mg/mL；乳酸體積分?jǐn)?shù)0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.50%），再次搖床培養(yǎng)2 h后平板計(jì)數(shù)測(cè)定菌落數(shù)。

1.3.3 微生物數(shù)量的測(cè)定

按GB4789.2—2010《食品微生物檢驗(yàn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》和GB/T4789.7—2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)副溶血性弧菌的檢驗(yàn)》，采用平板傾注計(jì)數(shù)法進(jìn)行菌落總數(shù)的測(cè)定。以無(wú)菌生理鹽水適當(dāng)稀釋超高壓處理后和未處理作為對(duì)照的供試菌懸液，于質(zhì)量濃度為3 g/100 mL氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

式中：n為搖床培養(yǎng)24h之后的菌落總數(shù)（lg（CFU/mL））；n0為初始（0 h）的菌落總數(shù)（lg（CFU/mL））。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次平行測(cè)定值的平均值，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS7.0軟件進(jìn)行ANOVA單因素方差分析，采用Origin8.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐壓菌的篩選和壓力耐受性檢測(cè)

經(jīng)80～250 MPa反復(fù)處理最終分離獲得的耐壓菌株經(jīng)250 MPa的壓力脅迫處理存活率較原始菌株大大提高。耐壓菌株和原始菌株均參照GB/T4789.7—2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)》經(jīng)生理生化鑒定為副溶血性弧菌，結(jié)果如表1所示。如圖1所示，未經(jīng)高壓處理的副溶血性弧菌原始菌株的菌落總數(shù)為9.2（lg（CFU/mL）），經(jīng)100、200、 250 MPa高壓處理后菌落總數(shù)分別降至8.8、8.2、4.4（lg（CFU/mL））。經(jīng)300 MPa及以上的壓力處理，副溶血性弧菌原始菌株全部致死。說(shuō)明副溶血弧菌原始菌株所能耐受的最高壓力250 MPa。耐壓菌株的菌落總數(shù)為8.8 （lg（CFU/mL）），經(jīng)100、200、250 MPa高壓處理后菌落總數(shù)分別降至8.6、8.0、6.3（lg（CFU/mL））。經(jīng)250 MPa的壓力處理后，耐壓菌的存活數(shù)量較原始菌株提高了2（lg（CFU/mL）），說(shuō)明該分離得到的菌株比原始菌株對(duì)超高壓有更強(qiáng)的耐受性。

表1 原始菌株和耐壓菌株生化鑒定結(jié)果Table 1 Biochemical appraisal results of pressure-sensitive and pressure-resistant straaiinnss

圖1 原始副溶血性弧菌與耐壓菌株的超高壓耐受性Fig.1 Ultra-high pressure tolerance of pressure-sensitive and pressureresistant Vibrio parahaemolyticus

2.2 原始菌株與耐壓菌株溫度耐受性差異分析

圖2 原始副溶血弧菌與耐壓菌株的溫度耐受性Fig.2 Temperature tolerance of pressure-sensitive and pressureresistant Vibrio parahaemolyticus

由圖2可知，經(jīng)－1、1、2、3、4、5 ℃培養(yǎng)24 h后，原始菌株的生長(zhǎng)速率分別為－0.04、－0.03、－0.03、－0.02、－0.01、－0.01，耐壓菌株的生長(zhǎng)速率分別為－0.02、0.01、0.03、0.04、0.06、0.07，比較可知，原始菌株在4 ℃以下低溫都處于負(fù)生長(zhǎng)，而耐壓菌株在1 ℃時(shí)仍有存活，并且在3、4、5 ℃生長(zhǎng)良好，說(shuō)明耐壓菌株比原始菌株對(duì)低溫更具耐受性（圖2A）。經(jīng)44、45、46、47、48、49 ℃培養(yǎng)24 h后，原始菌株的生長(zhǎng)速率分別為0.14、0.09、－0.24、－0.41、－0.58、－0.79，耐壓菌株的生長(zhǎng)速率分別為0.13、0.13、0.12、－0.01、－0.01、－0.04，原始菌株在46 ℃以上生長(zhǎng)速率為負(fù)值，說(shuō)明原始菌株在46 ℃以上高溫不能生長(zhǎng)，而耐壓菌株在46 ℃生長(zhǎng)良好，47、48 ℃的生長(zhǎng)速率接近0，說(shuō)明其在48 ℃仍能存活，故耐壓菌株比原始菌株更能耐受高溫脅迫（圖2B）。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得到，耐壓菌株不僅對(duì)壓力有很好的耐受性，對(duì)低溫和高溫的耐受性也增強(qiáng)。Huang Weishen等[9]研究了耐高濃度氯化鈉的副溶血性弧菌，在高溫、膽鹽、乙酸等逆境脅迫下，與原始菌株相比有更好的耐受性，與本實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果一致。

V. parahaemolyticus屬于低溫敏感型細(xì)菌，在低溫貯藏過(guò)程中可培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)逐漸下降[10-12]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，在生產(chǎn)實(shí)踐中，為有效減少水產(chǎn)品中的副溶血弧菌，可以選擇1 ℃以下的溫度貯存海產(chǎn)品。在烹飪過(guò)程中，也可采取48 ℃以上的溫度短時(shí)間處理水產(chǎn)品，并結(jié)合超高壓處理工藝，不僅保留了水產(chǎn)品的原始風(fēng)味，也能保證水產(chǎn)品的衛(wèi)生安全。

2.3 原始菌株與耐壓菌株氯化鈉耐受性差異分析

圖3 原始副溶血弧菌與耐壓菌株的氯化鈉耐受性Fig.3 NaCl tolerance of pressure-sensitive and pressure-resistant Vibrio parahaemolyticus

由圖3可知，經(jīng)0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/100 mL的NaCl培養(yǎng)2 4 h 后，原始菌株的生長(zhǎng)速率分別為－0.30、0.02、0.12、0.13、0.16、0.17，耐壓菌株的生長(zhǎng)速率分別為－0.38、0.03、0.13、0.14、0.17、0.18。NaCl質(zhì)量濃度為0.2 g/100 mL時(shí)，原始菌株的生長(zhǎng)速率大于0，而耐壓菌株為負(fù)生長(zhǎng)，說(shuō)明在該體積分?jǐn)?shù)下，原始菌株比耐壓菌株耐受性強(qiáng)。而當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度在0.3、0.4、0.5、0.6 g/100 mL時(shí)，耐壓菌株的生長(zhǎng)速率均比原始菌株大，說(shuō)明在這些質(zhì)量濃度下耐壓菌株的耐受性大于原始菌株（圖3A）。經(jīng)10、10.5、11、11.5、12、12.5 g/100 mL的NaCl培養(yǎng)24 h后，原始菌株的生長(zhǎng)速率分別為0.17、0.11、－0.10、－0.27、－0.57、－0.78，耐壓菌株的生長(zhǎng)速率分別為0.08、0.01、0.01、－0.01、－0.36、－0.28，NaCl質(zhì)量濃度為11 g/100 mL時(shí)，原始菌株幾乎全部死亡，而耐壓菌株仍有部分存活，故耐壓菌株的高質(zhì)量濃度NaCl耐受性較原始菌株更強(qiáng)（圖3B）。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得到，N a C l質(zhì)量濃度為0.2 g/100 mL時(shí)，耐壓菌株的耐受性比原始菌株弱，但是當(dāng)質(zhì)量濃度為0.3 g/100 mL以上時(shí)，耐壓菌株的耐受性比原始菌株強(qiáng)。而高質(zhì)量濃度NaCl時(shí)耐壓菌株比原始菌株耐受性更強(qiáng)。由于耐壓菌在不斷的壓力環(huán)境下，細(xì)胞的生理或構(gòu)成上發(fā)生改變，使細(xì)菌達(dá)到與環(huán)境相適應(yīng)，從而對(duì)其他的逆境環(huán)境耐受性也增強(qiáng)。Chiang等[13]研究了熱脅迫下的副溶血弧菌對(duì)低質(zhì)量濃度NaCl 0.1 g/100 mL更具耐受性，而在高質(zhì)量濃度NaCl20 g/100 mL比原始菌株反而敏感，說(shuō)明在不同逆境條件脅迫下生存下來(lái)的微生物處于其他極端環(huán)境時(shí)可能會(huì)表現(xiàn)出不同的耐受性與抗性。

2.4 原始菌株與耐壓菌株pH值耐受性差異分析

圖4 原始副溶血弧菌與耐壓菌株的pH值耐受性Fig.4 pH tolerance of pressure-sensitive and pressure-resistant Vibrio parahaemolyticus

由圖4可知，經(jīng)pH值為3.1、3.4、3.7、4.0、4.3、4.6的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，原始菌株的生長(zhǎng)速率分別為－1.00、－1.00、－0.86、－0.82、－0.70、0.21，耐壓菌株的生長(zhǎng)速率分別為－1.00、－1.00、－0.76、－0.71、－0.64、0.17。pH 4.3以下，原始菌株與耐壓菌株不能存活，pH 4.6時(shí)，原始菌株生長(zhǎng)速率高于耐壓菌株，耐壓菌的低pH值耐受性比原始菌株略低，但是差異不顯著（P＞0.1）（圖4A）。經(jīng)pH值為10.6、11.0、11.4、11.8、12.2、12.6的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，原始菌株的生長(zhǎng)速率分別為0.20、0.19、0.17、0.10、－0.09、－0.80，耐壓菌株的生長(zhǎng)速率分別為0.17、0.15、0.14、0.05、－0.22、－1.00，在pH值大于12.2時(shí)，原始菌株與耐壓菌株生長(zhǎng)速率均小于0，說(shuō)明兩種菌株對(duì)高pH值的耐受性相似（圖4B）。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得到，耐壓菌株最低和最高生長(zhǎng)pH值均與原始菌株一致，說(shuō)明耐壓菌株對(duì)酸性和堿性條件的耐受性并沒(méi)有發(fā)生變化。Lin等[14]研究發(fā)現(xiàn)熱脅迫后李斯特菌對(duì)不同逆境的耐受性因菌株、熱脅迫條件以及隨后的逆境條件而異。Lin等[15]發(fā)現(xiàn)冷脅迫后的副溶血弧菌對(duì)乳酸和乙酸更加敏感，Bollman等[16]在對(duì)大腸桿菌的研究中同樣發(fā)現(xiàn)了這種現(xiàn)象。Tetsuro等[17]研究發(fā)現(xiàn)，堿脅迫下的副溶血弧菌對(duì)其他的逆境環(huán)境如結(jié)晶紫、過(guò)氧化氫的耐受性增強(qiáng)，但是熱脅迫下的副溶血弧菌并沒(méi)有對(duì)堿性環(huán)境的耐受性增強(qiáng)，Chang等[18]也發(fā)現(xiàn)熱脅迫下的副溶血弧菌對(duì)一些逆境表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐受性，但對(duì)有些逆境環(huán)境反而更加敏感。說(shuō)明脅迫條件下的交互保護(hù)作用并不是一定的。

有報(bào)道指出壓力可導(dǎo)致微生物細(xì)胞脂質(zhì)成分的變化，可能會(huì)影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性和滲透力, 當(dāng)細(xì)胞處于高壓環(huán)境中時(shí)，不飽和脂肪酸的含量就會(huì)增加[19-21]。這是否是導(dǎo)致上述現(xiàn)象的原因，需要進(jìn)一步的觀察與研究。

2.5 原始菌株與耐壓菌株有機(jī)溶劑耐受性差異分析

圖5 原始副溶血弧菌與耐壓菌株的有機(jī)溶劑耐受性Fig.5 Organic solvent tolerance of pressure-sensitive and pressureresistant Vibrio parahaemolyticus

有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞的毒性主要是破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能[22]，選擇極性從大到小的4種有機(jī)溶劑（乙醇6.9、丙酮5.4、正丁醇3.7、甲苯2.4）檢測(cè)副溶血弧菌原始菌株和耐壓菌株對(duì)有機(jī)溶劑耐受性的不同，結(jié)果如圖5所示。兩種菌株對(duì)極性系數(shù)＞4的有機(jī)溶劑（乙醇和丙酮）比對(duì)極性系數(shù)＜4的有機(jī)溶劑（正丁醇和甲苯）的耐受性更強(qiáng)。并且當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)12%、丙酮體積分?jǐn)?shù)9%和甲苯體積分?jǐn)?shù)為0.75%時(shí)，原始菌株全部致死，耐壓菌株仍有1.5、2.0、0.6（lg（CFU/mL）），因此，耐壓菌株對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性強(qiáng)于原始菌株。彭慧等[23]篩選得到一株高乙醇耐受的嗜熱細(xì)菌對(duì)其他有機(jī)溶劑（如異丙醇、庚烷、甲醇等）均有更好的耐受性，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

2.6 原始菌株與耐壓菌株有機(jī)酸耐受性差異分析

圖6 副溶血弧菌與耐壓菌株的有機(jī)酸耐受性Fig.6 Organic acid tolerance of pressure-sensitive and pressureresistant Vibrio parahaemolyticus

有機(jī)酸作為防腐劑在食品工業(yè)中被廣泛應(yīng)用。選擇4種常見(jiàn)的有機(jī)酸（檸檬酸、蘋(píng)果酸、酒石酸、乳酸）檢測(cè)副溶血弧菌原始菌株和耐壓菌株對(duì)有機(jī)酸耐受性的不同，結(jié)果如圖6所示。兩種菌株的存活率均隨有機(jī)酸質(zhì)量濃度的上升而下降，但是耐壓菌株耐受4種有機(jī)酸的能力均比原始菌株強(qiáng)，其中檸檬酸和乳酸在3 mg/mL和1.5%時(shí)，原始菌株全部致死，而耐壓菌株仍有1.3、0.9（lg（CFU/mL）），說(shuō)明耐壓菌株對(duì)有機(jī)酸有更強(qiáng)的耐受性。Liu Xiaoxiang等[24]研究發(fā)現(xiàn)能耐受低劑量茶多酚的綠膿假單胞菌對(duì)乳酸、乙酸、丙酸等有機(jī)酸也有很好的耐受性，說(shuō)明綠膿假單胞菌在耐受茶多酚與耐有機(jī)酸方面有一定的交互抗性。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)表明由原始副溶血性弧菌經(jīng)多次超高壓處理得到的耐高壓脅迫菌株經(jīng)生理生化鑒定為副溶血性弧菌。耐壓菌株經(jīng)超高壓250 MPa處理存活量比原始菌株高2（lg（CFU/mL）），原始菌株在逆境條件低溫（1 ℃）、高溫（48 ℃）、高質(zhì)量濃度氯化鈉（11.5 g/100 mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)12%、丙酮體積分?jǐn)?shù)9%、甲苯體積分?jǐn)?shù)0.75%，檸檬酸3 mg/mL和乳酸體積分?jǐn)?shù)1.5%時(shí)，生長(zhǎng)速率為零或負(fù)值，而耐壓菌株在這些逆境條件下仍可保持一定的生長(zhǎng)速率，說(shuō)明耐壓菌株對(duì)其他逆境的耐受性較原始菌株有不同程度提高。超高壓誘導(dǎo)產(chǎn)生耐脅迫菌株的機(jī)理目前尚未明確。有研究表明，細(xì)菌在亞致死壓力脅迫下，會(huì)產(chǎn)生一系列應(yīng)激反應(yīng)，細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)可能發(fā)生相應(yīng)變化以抵抗壓力的脅迫，細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白分子量發(fā)生相應(yīng)變化，細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸含量升高以及細(xì)胞內(nèi)幾種抗氧化酶活力的升高等，細(xì)菌可以通過(guò)一系列生理反應(yīng)以適應(yīng)外界環(huán)境的變化，從而提高對(duì)高壓脅迫的耐受性[25-26]。耐壓菌株較原始菌株對(duì)逆境的耐受性更強(qiáng)，但在酸性和堿性條件下，耐壓菌株與原始菌株的耐受性差異不顯著。副溶血性弧菌主要通過(guò)水產(chǎn)品傳播，因此，在水產(chǎn)品加工處理過(guò)程中，為有效殺滅致病性微生物副溶血性弧菌特別是耐壓菌株，利用超高壓殺菌技術(shù)的同時(shí)，輔以熱處理、冷凍、添加防腐劑等協(xié)同方法，從而為有效控制副溶血性弧菌的擴(kuò)散和污染，使超高壓技術(shù)更好地應(yīng)用于水產(chǎn)品的殺菌與保鮮。

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Susceptibility of Pressure-Resistant Vibrio parahaemolyticus to Various Environmental Stresses

HUANG Xiao-ming1, TONG Yu1, MA Jun-yan1, ZHU Kai-li1, ZHOU Yang-wu1, LU Hai-xia1,*, LI Jian-rong2
(1. Food Safety Key Laboratory of Zhejiang Province, College of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310035, China; 2. Food Safety Key Laboratory of Liaoning Province, College of Chemistry, Chemical Engineering and Food Safety, Bohai University, Jinzhou 121013, China)

Objective: The objective of this study was to observe the susceptibility of Vibrio parahaemolyticus to various environment stresses as influenced by high hydrostatic pressure treatments. Methods: A pressure-sensitive strain of V. parahaemolyticus (ZJGSMC001) isolated from seafoods was repeatedly treated with high hydrostatic pressures ranging from 80 to 250 MPa, and the surviving cells were selected as pressure-resistant strains (ZJGSPR001). The tolerance of V. parahaemolyticus to subsequent adverse conditions was investigated in the pressure-sensitive strains as well as the pressureresistant strains. Results: When exposed to a pressure of 250 MPa, the survival of pressure-resistant strains was 2 (lg (CFU/mL)) higher than that of pressure-sensitive strains. When exposed to low temperature (1 ℃) and high temperature (45 ℃), pressuresensitive strains could not survive, while the pressure-resistant ones grew well and still survive at 1 ℃or 48 ℃. Pressuresensitive strains could not grow at high salt concentration such as 11.5 g/100 mL NaCl. However, pressure-resistant bacteria could survive and grow well. Pressure-resistant strains were more resistant to organic solvent and organic acids compared to the pressure-sensitive ones. When exposed to alcohol (12%), acetone (9%), toluene (0.75%), citric acid (3 mg/mL) and lactic acid (1.5%), the pressure-sensitive bacteria were totally dead, while the pressure-resistant cells remained alive. Conclusion: The pressure-resistant V. parahaemolyticus is more tolerant to environment stresses such as temperature, NaCl solution, organic solvent and organic acids than the pressure-sensitive strains.

Vibrio parahaemolyticus; pressure-resistant bacteria; environmental stresses

Q93-3

A

1002-6630（2014）07-0164-06

10.7506/spkx1002-6630-201407033

2013-05-15

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（Y3100675）；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD29B06）

黃小鳴（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。E-mail：huangxiaoming1027@126.com

*通信作者：陸海霞（1977—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工與質(zhì)量控制。E-mail：luhaixia@ zjgsu.edu.cn