游離態(tài)葉黃素和玉米黃素體外單線態(tài)氧淬滅率的比較研究

翟艷麗，惠伯棣*，宮 平，楊博媛

（北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院食品科學(xué)系，北京 100191）

游離態(tài)葉黃素和玉米黃素體外單線態(tài)氧淬滅率的比較研究

翟艷麗，惠伯棣*，宮 平，楊博媛

（北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院食品科學(xué)系，北京 100191）

為比較玉米黃素和葉黃素單體的體外淬滅單線態(tài)氧能力，本實驗分別萃取萬壽菊與枸杞中的葉黃素與玉米黃素酯，經(jīng)皂化和純化后得到游離的葉黃素與玉米黃素組分。使用C30-HPLC-PDA 分別對制備組分進(jìn)行定性和定量分析。用次氯酸鈉-雙氧水反應(yīng)產(chǎn)生單線態(tài)氧，使用微弱發(fā)光測量儀測定制備組分對單線態(tài)氧的淬滅率。結(jié)果顯示：游離葉黃素和玉米黃素均能減少次氯酸鈉-雙氧水反應(yīng)體系產(chǎn)生的單線態(tài)氧數(shù)量，導(dǎo)致最大光子計數(shù)值下降。二者淬滅單線態(tài)氧的能力相似，最小作用劑量均為0.005～0.05 g/L。

玉米黃素；葉黃素；微弱發(fā)光分析；單線態(tài)氧；自由基；淬滅

葉黃素（lutein）和玉米黃素（又名玉米黃質(zhì)，zeaxanthin）是含羥基的類胡蘿卜素的同分異構(gòu)體，分子式為C40H56O2，相對分子質(zhì)量為568，二者分子結(jié)構(gòu)見圖1[1-2]。大部分存在于自然界中的葉黃素和玉米黃素為全反式異構(gòu)體，且以雙酯（如雙棕櫚酸酯）的形式存在。

食品中使用的葉黃素主要來源于萬壽菊（marigold，Tagetes erecta L.）的花。萬壽菊花中含有豐富的類胡蘿卜素化合物，主要為葉黃素雙酯[3]。食品中使用的玉米黃素主要來源于枸杞（wolfberry，Lycium chinense Mill.）的果實中。枸杞果實中存在著數(shù)量豐富的玉米黃素二棕櫚酸酯[4]。本實驗以萬壽菊花和枸杞果實作為原料，萃取葉黃素和玉米黃素雙酯，經(jīng)皂化制成高純度的游離態(tài)葉黃素和玉米黃素。

圖1 葉黃素（a）與玉米黃素（b）分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structures of lutein (a) and zeaxanthin (b)

許多臨床實驗的結(jié)果證明：葉黃素和玉米黃素具有對人體視網(wǎng)膜及黃斑的保護(hù)和調(diào)節(jié)人體免疫功能等作用[1]。因此，二者均被應(yīng)用于保健食品、食品著色劑和飼料中。葉黃素與玉米黃素的分子結(jié)構(gòu)中都包含多個共軛雙烯結(jié)構(gòu)，因此具有顯著的抗氧化性質(zhì)。二者的抗氧化性質(zhì)最終決定了它們的上述健康功能。由于二者的結(jié)構(gòu)相似，比較進(jìn)而發(fā)現(xiàn)它們在性質(zhì)（尤其是在食品中的抗氧化能力）上的區(qū)別成為人們關(guān)注的問題。這也關(guān)系到二者在食品中應(yīng)用的定位。

自由基是能獨立存在的含有一個或一個以上不配對電子的原子或原子團(tuán)，具有較活潑的化學(xué)性質(zhì)[5]。單線態(tài)氧（1O2）是一種活性氧自由基，處于激發(fā)態(tài)，經(jīng)常作為鏈?zhǔn)窖趸磻?yīng)的誘導(dǎo)物。單線態(tài)氧在許多生命活動中都起著重要的作用，例如，與生物膜損傷、細(xì)胞衰老和癌癥等疾病有密切關(guān)系[6-7]。在向低能態(tài)躍遷時，1O2可向外界輻射光子[8-9]。1963年，Khan等[10]建立了用NaClO和H2O2反應(yīng)體系產(chǎn)生單線態(tài)氧，并可釋放光子，二者數(shù)量相關(guān)，見式（1）。因此，對反應(yīng)體系的光子計數(shù)可測定體系產(chǎn)生單線態(tài)氧的數(shù)量。

NaClO＋H2O2→NaCl＋H2O＋1O2＋hv （1）

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙醇、正己烷、四氫呋喃、30%過氧化氫、氫氧化鉀和次氯酸鈉均為分析純試劑 北京化工廠；乙腈、乙酸乙酯均為色譜純試劑 迪馬公司；柱層析用硅膠（60～100目） 青島海洋化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜設(shè)備由Waters 1525溶劑輸送系統(tǒng)和Waters 2996檢測器組成；C30YMCTMCarotenoid（4.5 mm×250 mm，5 μm）色譜柱 日本YMC公司；MultiSpec-1501型紫外-可見分光光度計 日本Shimadzu公司；BPCL-2-JZSH型（雙反應(yīng)池）微弱發(fā)光分析儀中國科學(xué)院生物物理研究所。

1.3 方法

1.3.1 葉黃素和玉米黃素酯與單體的制備

取5 g萬壽菊干花顆粒于研缽中，加入4倍體積的正己烷進(jìn)行反復(fù)研磨，用滴管收集上清液，反復(fù)萃取3遍，合并收集上清液。在真空旋轉(zhuǎn)干燥儀上旋蒸濃縮萃取液至20 mL，條件：45 ℃、－0.08 MPa、60 r/min。將濃縮物置于100 mL三角瓶中，加入等體積的10%氫氧化鉀-乙醇溶液，加導(dǎo)氣管后，避光在磁力攪拌器上攪拌過夜皂化[17]。皂化完全后，將反應(yīng)物轉(zhuǎn)移至250 mL分液漏斗中，加入50 mL乙醚和50 mL 2%的氯化鈉水溶液。緩慢搖動后，靜止。待分層后，收集上相。用氮氣將乙醚吹干，得到游離態(tài)葉黃素組分。

在依照前文中的標(biāo)準(zhǔn)完成種子的選擇之后，可以通過科學(xué)的種子處理來增加種子的抗逆性和出苗率。具體措施為先使用15℃的涼水將種子浸濕，隨后放入54℃的溫水中浸泡15分鐘，等水溫冷卻至20℃的時候再浸泡12小時左右完成浸種。在浸種完成中，需要進(jìn)行催芽處理。將浸好的種子撈出洗凈之后，用濕布包裹完好，放置于27℃左右的恒溫中催芽3天。需要注意的是，在催芽的過程中每天需要翻動幾次包裹，并采用清水進(jìn)行淘洗。通過上述操作，可以大幅度增加種子的出芽速度和出苗率。

取200 g枸杞果實于3 000 mL燒杯中，加水2 000 mL。小火煮沸2 h后撈出，放在表面皿中，在70 ℃真空烘箱烘至恒質(zhì)量，得到76 g干燥物。在研缽中，將干燥物碾碎，篩出籽，收集破碎的果肉和果皮。取10 g干燥的果肉和果皮于研缽中，萃取、皂化方法同葉黃素的制備，得到游離態(tài)玉米黃素組分。

1.3.2 制備物中總類胡蘿卜素含量的UV-Vis測定

分別定量稱取游離葉黃素和玉米黃素制備物，用無水乙醇定容。用紫外-可見光分光光度計測量溶液在449 nm波長處的吸光度，并根據(jù)公式（2）分別計算兩個制備組分中總類胡蘿卜素的含量[2,18]。

式中：x為樣品中總類胡蘿卜素的含量/g；y樣品溶液的體積/mL；A為樣品的吸光度；A1%1cm為吸光系數(shù)，在此，葉黃素采用值為2 200，玉米黃素采用值為2 480。

1.3.3 制備物中類胡蘿卜素組成的C30-HPLC分析

分別稱取適量游離葉黃素與玉米黃素制備物，使用丙酮溶解，過0.45 nm濾膜后，用于HPLC分析。H P L C條件：色譜柱為C30Y M CTMC a r o t e n o i d（4.5 mm×250 mm，5 μm）；流動相A為乙腈-甲醇（3∶1，V/V）；流動相B為甲基叔丁基醚（methyl tretbutyl ether，MTBE）。線性梯度洗脫：B在15 min內(nèi)從0%升至40%，之后在15 min到25 min內(nèi)從40%升至100%，流速為1 mL/min，檢測波長為450 nm，進(jìn)樣量為20 μL[19]。根據(jù)HPLC色譜行為、光譜特征及與已有的文獻(xiàn)記載對比，對各組分進(jìn)行鑒定。按峰面積歸一法，根據(jù)式（3）分別計算制備物中游離葉黃素和玉米黃素組分在總類胡蘿卜素中所占的比例。

1.3.4 制備物中游離葉黃素和玉米黃素的含量計算

按式（4）、（5）計算制備物中游離葉黃素和玉米黃素的含量。

1.3.5 體外單線態(tài)氧淬滅率的比較

分別稱取一定量的游離葉黃素與玉米黃素組分溶于四氫呋喃中，配制成3種質(zhì)量濃度分別為0.5、0.05、0.005 g/L的溶液。

在進(jìn)行單線態(tài)淬滅率測量時，首先用14C源校正微弱發(fā)光測量儀至30 000光子計數(shù)值。測量條件及測量方法為：雙樣品數(shù)據(jù)采集間隔為0.1 s，收集時間為30 s。在樣品測量杯中順次加入0.15 mL次氯酸鈉和0.15 mL樣品，混勻后將測量杯放入樣品池中，關(guān)閉檢測室門，啟動接收光子計數(shù)信號，待基線穩(wěn)定后，注入0.15 mL雙氧水，同時開始計時記錄光子計數(shù)信號。在參比樣品測量杯中的操作同上，樣品溶液換為四氫呋喃。記錄每個樣品的反應(yīng)時間—光子計數(shù)圖。由于該反應(yīng)受到多種環(huán)境因素的影響，為確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，每個樣品重復(fù)6次，按式（6）計算淬滅率[1,3]。實驗結(jié)果以淬滅率的表示。采用SPSS 13.0軟件處理數(shù)據(jù)，對相同質(zhì)量濃度下葉黃素與玉米黃素的單線態(tài)氧淬滅率進(jìn)行T檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 游離葉黃素和玉米黃素組分的類胡蘿卜素組成

圖2 葉黃素（a）和玉米黃素（b）制備物色譜圖Fig.2 C30-HPLC profiles of lutein (a) and zeaxanthin (b) fractions

圖3 組分Ⅰ（a）和Ⅱ（b）的電子吸收光譜圖Fig.3 Electronic absorption spectra of fraction Ⅰ(a) and Ⅱ (b)

在萬壽菊花和枸杞果實中，葉黃素和玉米黃素均主要以酯的形式存在，經(jīng)過強堿條件下的皂化后水解為游離態(tài)分子。用圖2、3給出的信息與參考文獻(xiàn)[19]上報道的結(jié)果比較，可以得出結(jié)論如下：制備組分Ⅰ和Ⅱ可定性為游離葉黃素和玉米黃素；按峰面積歸一法（式（3））計算，制備組分中游離葉黃素和玉米黃素分別占總類胡蘿卜素的97.3%和98.8%，即：兩個制備物的類胡蘿卜素組成相當(dāng)單一。

2.2 制備物中游離態(tài)葉黃素與玉米黃素的含量

經(jīng)分光光度法測定，葉黃素制備物中總類胡蘿卜素的含量為76.6%。按式（4）、（5），其中游離葉黃素含量達(dá)到74.5%。玉米黃素制備物中總類胡蘿卜素的含量為71.0%，其中玉米黃素含量達(dá)到70.1%。

2.3 游離態(tài)葉黃素和玉米黃素制備組分的單線態(tài)氧淬滅率

圖4 次氯酸鈉-雙氧水反應(yīng)體系的時間-光子計數(shù)圖Fig.4 Time-photon count profile for NaClO/H2O2reaction

圖4 為游離玉米黃素0.005 g/L質(zhì)量濃度的次氯酸鈉-雙氧水反應(yīng)體系的時間-光子計數(shù)圖。其他5個樣品的光子計數(shù)圖類同。此外，BPCL-2-JZSH 型微弱發(fā)光分析儀具有雙反應(yīng)池，可同時進(jìn)行樣品和參比樣品的測量。這在很大程度上減小了實驗結(jié)果的誤差。在實際操作中，由于采用的是雙反應(yīng)池設(shè)備，樣品與參比樣品同時檢測，淬滅率可在數(shù)據(jù)處理時同步給出。

表1 葉黃素與玉米黃素在不同質(zhì)量濃度下的單線態(tài)氧淬滅率Table 1 Effect of different concentrations of free lutein and zeaxanthin on singlet oxygen quenching rate

表1 葉黃素與玉米黃素在不同質(zhì)量濃度下的單線態(tài)氧淬滅率Table 1 Effect of different concentrations of free lutein and zeaxanthin on singlet oxygen quenching rate

%組別質(zhì)量濃度/（g/L）0.50.050.005游離態(tài)葉黃素游離態(tài)玉米黃素81.25±4.04 75.32±6.41 75.96±6.16 68.06±9.07 44.19±3.24 34.32±10.32

圖5 游離態(tài)葉黃素與玉米黃素質(zhì)量濃度變化對其單線態(tài)氧淬滅率的影響Fig.5 Effects of different concentrations of free lutein and zeaxanthin on singlet oxygen quenching rate

圖5 顯示了游離態(tài)葉黃素和玉米黃素質(zhì)量濃度變化對它們單線態(tài)氧淬滅率的影響。鑒于次氯酸鈉-雙氧水反應(yīng)受環(huán)境因素的影響較明顯，因此個別組數(shù)據(jù)的離散程度較大。對相同質(zhì)量濃度下葉黃素與玉米黃素的單線態(tài)氧淬滅率進(jìn)行T檢驗，0.5、0.05、0.005 g/L不同質(zhì)量濃度下雙尾檢測P值依次為0.084、0.108、0.067，均大于0.05，統(tǒng)計結(jié)果不具有顯著性差異。

綜上所述可知，當(dāng)反應(yīng)體系中加入游離態(tài)葉黃素或玉米黃素制備物后，反應(yīng)體系的最大光子計數(shù)值均降低，即：淬滅率均為正值；相同質(zhì)量濃度的游離態(tài)葉黃素和玉米黃素對單線態(tài)氧的淬滅能力相同；增加反應(yīng)體系中游離態(tài)葉黃素或玉米黃素的量，能夠提高對單線態(tài)氧的淬滅能力。當(dāng)二者的質(zhì)量濃度達(dá)到0.05 g/L時，其淬滅率均超過50%。這一結(jié)果可以作為這兩種化合物在體內(nèi) 發(fā)揮淬滅自由基作用時的量效關(guān)系依據(jù)。

3 討 論

在實驗制備的游離態(tài)葉黃素和玉米黃素樣品的純度分別為74.5%和70.1%。顯然，在樣品中除了類胡蘿卜素外，還有其他非皂化物組分。在樣品淬滅單線態(tài)氧時，這部分非皂化物很可能參與了反應(yīng)。這部分非皂化物組分與淬滅率的量效關(guān)系給本項研究的結(jié)果可能帶來不確定因素。然而，70%左右的樣品純度是目前我國食品行業(yè)中大部分工業(yè)中間體產(chǎn)品的純度水平。因此，實驗結(jié)果還是具有一定的實踐參考價值。本研究結(jié)果表明：葉黃素和玉米黃素在量效關(guān)系上具有基本相近的體外淬滅單線態(tài)氧的能力。當(dāng)二者的質(zhì)量濃度達(dá)到0.05 g/L時，其淬滅率均超過50%。這可能是由于二者分子中央共軛多烯鏈中的雙鍵數(shù)量相同。端基六元環(huán)上的結(jié)構(gòu)變化對二者淬滅單線態(tài)氧能力的影響可能不明顯。但是，端基六元環(huán)上的結(jié)構(gòu)變化還是可能造成了兩種分子淬滅單線態(tài)氧能力的細(xì)微差別。二者的分子結(jié)構(gòu)在端基芳香環(huán)上電子云偏移的空間取向有所差別。這一差別可導(dǎo)致分子中央共軛體系電子云的偏移程度不同，最終可能影響到二者淬滅單線態(tài)氧的能力。

游離態(tài)葉黃素與玉米黃素制備物淬滅單線態(tài)氧能力的相似性對可以對評估二者在體內(nèi)的生物學(xué)功能具有一定的參考價值。例如，在人體中，視網(wǎng)膜黃斑是二者共同的靶器官之一。在量效關(guān)系上，二者淬滅單線態(tài)氧能力的一致性與靶器官的一致性之間的相關(guān)性可成為今后需要探討的研究領(lǐng)域。如果這種相關(guān)性存在，游離態(tài)葉黃素與玉米黃素在視網(wǎng)膜黃斑中發(fā)揮了淬滅自由基功能這一結(jié)論就可能得到佐證。

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Comparative Study of Singlet-Oxygen Quenching Capacity between Free Lutein and Zeaxanthin in vitro

ZHAI Yan-li, HUI Bo-di*, GONG Ping, YANG Bo-yuan
(Department of Food Science, College of Applied Arts and Science, Beijing Union University, Beijing 100191, China)

This study aimed to compare the abilities of free zeaxanthin and lutein to quench singlet oxygen in vitro. Lutein and zeaxanthin esters were extracted from marigold flowers and wolfberry fruits, respectively. After being saponified and purified, free lutein and zeaxanthin fractions were obtained from the two extracts, respectively. The fractions were identified and quantified on C30-HPLC-PDA. A reaction between NaClO and H2O2was then performed to produce singlet oxygen. The singlet oxygen quenching rates of free lutein and zeaxanthin fractions were determined, respectively, on an ultra-weak luminescience analyzer. Data from ultra-weak luminescience analysis suggested that both lutein and zeaxanthin fractions were capable of reducing the amount of singlet oxygen produced and the maximum number of photons generated from the reaction. A minimum amount of 0.005－0.05 g/L that resulted in more than 50% reduction of maximum photon number was observed with both fractions and their abilities to quench singlet oxygen were similar.

zeaxanthin; lutein; ultra-weak luminescience analysis; singlet oxygen; free radical; quenching

R965

A

1002-6630（2014）07-0077-04

10.7506/spkx1002-6630-201407016

2013-05-17

翟艷麗（1988—），女，碩士研究生，研究方向為類胡蘿卜素及生物化學(xué)。E-mail：219zyl@163.com

*通信作者：惠伯棣（1959—），男，教授，博士，研究方向為類胡蘿卜素及生物化學(xué)。E-mail：bodi_hui@ygi.edu.cn