超高壓液相色譜-高分辨質譜快速篩查和確證食用貝類中多種原多甲藻酸貝類毒素

韓 深，劉 鑫，李建輝，王珮玥，古 瑾，張朝暉*

（北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，北京 100026）

超高壓液相色譜-高分辨質譜快速篩查和確證食用貝類中多種原多甲藻酸貝類毒素

韓 深，劉 鑫，李建輝，王珮玥，古 瑾，張朝暉*

（北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，北京 100026）

建立超高壓液相色譜-高分辨質譜快速篩查和確證貽貝、牡蠣、蚌類、扇貝等食用貝類及其制品中3種天然形式的原多甲藻酸貝類毒素的檢測方法。樣品中的原多甲藻酸采用乙腈-水體系均質提取，應用改進型QuEChERS技術凈化，在乙腈-水（含5 mmol/L醋酸銨和0.1%甲酸）體系經Acquity HSS T3柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）梯度洗脫，實現了3種原多甲藻酸貝類毒素的基線分離。該方法基于電噴霧正離子模式，采用高分辨質譜一級全掃描和數據依賴掃描，對食用貝類及其制品樣品中的原多甲藻酸貝類毒素進行檢測。3種貝類毒素的定量限均為10 μg/kg（RSN＞10）；在10～500 μg/L范圍內線性關系良好，相關系數（R2）均大于0.99。應用該方法對國內外多個地區的貝類產品進行了篩查及確證，其中部分樣品檢出原多甲藻酸貝類毒素。該方法靈敏度高，重復性好，操作簡便、快捷，適用于食用貝類及其制品中多種原多甲藻酸貝類毒素的篩查分析。

原多甲藻酸貝類毒素；超高壓液相色譜-高分辨質譜；QuEChERS

自20世紀末期，隨著全球工業化進程飛速發展，海洋環境遭受嚴重污染，其中由有毒赤潮產生的藻毒素成為污染海水養殖環境的新要素，嚴重威脅到水產品食用安全[1]。原多甲藻酸貝類毒素（azaspiracids shellfish toxins，AZAs）是近年來先于歐洲發現的一類新型聚醚類生物毒素[2]，1995年在愛爾蘭Killary海灣的紫貽貝中首次被檢測到，它是一種具有6,5,6-三螺環和環胺結構的親脂性聚醚類海洋生物毒素[3-4]，結構式見表1。

目前已確定化學結構的原多甲藻酸貝類毒素已有11種，其中屬AZA-1、AZA-2及AZA-3是最常見且毒性最大的3種[3,5]。AZAs主要引起人體胃腸道紊亂，通常在進食12～24 h后發作，此外，AZAs還能導致多種器官損傷，且這類毒素相對比較穩定，在酸性、堿性和高溫條件都不能使其毒性降低[6]。據估算，當攝入AZA-1劑量為23 ?g/人和86 ?g/人時，致毒概率分別為5%和95%，對人的平均致毒劑量為51.7 ?g/人[7]。2004年，由聯合國糧農組織、世界衛生組織和政府間海洋委員會共同組建了服務于漁業和水產品法典委員會的雙殼軟體生物毒素工作組，將原多甲藻酸歸為八大類貝類生物毒素之一[8]。鑒于原多甲藻酸貝類毒素的危害性，歐盟立法機構確立雙殼軟體動物中AZAs的最大允許限量是160 ?g/kg[9]。

目前報道的原多甲藻酸的檢測方法主要包括：生物測試法、液相色譜-質譜聯用法等。采用生物法進行檢測，往往會產生假陰性結果而造成實驗結果不準確[10]。液相色譜技術是分析生物毒素的一類高效的手段，但由于AZAs毒素在波長大于210 nm的范圍缺少特征吸收峰，因此目前還未見相關采用液相色譜分析AZAs的報道。隨著液相色譜-質譜聯用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）技術的發展和不斷完善，人們逐漸嘗試建立了一些LC-MS分析方法來測定這類毒素[11-l6]，由于貝類海產品及其制品基質較為復雜，采用單級質譜測定的結果可能會產生假陽性。線性離子阱-靜電場軌道阱高分辨質譜由于具有質量分辨率高和精確分子質量的功能，最近成為人們研究和應用的新熱點。該方法在全掃描模式下采集的數據可以根據檢測需求反復調用，因此其可以彌補傳統低分辨質譜方法無法應對法規更新頻繁的不足；其數據依賴性掃描可以在篩查的同時，通過碎片離子進行定性確證。

本實驗基于QuEChERS前處理技術，運用超高效液相色譜和高分辨率質譜聯用技術，對貽貝、牡蠣、蚌類、扇貝等食用貝類及其制品中3種天然形式的原多甲藻酸貝類毒素進行分析測定。相比低分辨率質譜，運用高分辨質譜一級全掃描和數據依賴掃描進行檢測分析，在很大程度上降低了出現假陽性結果的可能性，使檢測更加準確。同時，采用超高壓液相色譜系統進行分離，不但節省試劑消耗，更提高了分析效率，3個毒素化合物在10 min內可完成分析，較好地實現了對貽貝、蚌類等的可食用貝類及其制品基體中3種AZAs貝類毒素的分析與測定。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

貽貝、牡蠣、象拔蚌和扇貝4種食用貝類及其制品市售。

3種原多甲藻酸標準品AZA-1、AZA-2和AZA-3（純度均≥99.0%） 美國Supelco公司（表1）；乙腈、乙酸銨、甲醇、乙酸乙酯（均為色譜純） 美國Fisher公司；甲酸（色譜純） 美國Tedia公司；無水硫酸鎂、氯化鈉（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；C18基質固相分散萃取分散劑 美國Agilent公司；微纖維濾紙 美國Vicam公司；微孔濾膜（0.2 μm） 美國Whatman公司；超純水（電阻率為18.2 MΩ）經Milli-Q凈化系統過濾。用甲醇配制3種原多甲藻酸貝類毒素的標準儲備液，于－20 ℃條件下保存，保存期為6個月；配制標準工作曲線時，根據要求將儲備液稀釋成不同質量濃度，于－20 ℃條件下保存，工作曲線現用現配。

Orbitrap超高壓液相色譜-高分辨質譜聯用儀 美國Thermo Fisher Scientif c公司；高速均質機 美國Waring公司；離心機 美國Sigma公司；漩渦混勻器 德國IKA公司；旋轉蒸發儀 日本Eyela公司；Milli-Q超純水裝置 美國Millipore公司。

表1 3種原多甲藻酸貝類毒素標準對照品信息Table 1 Information about 3 azaspiracid standards

1.2 方法

1.2.1 色譜-質譜條件

1.2.1.1 色譜條件

色譜柱：Acquity HSS T3柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）；流動相：乙腈（A）和水溶液（含5 mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸）（B）；流速：250 μL/min；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃。梯度洗脫程序：0～1 min，20%～50% A；1～6 min，50%～90% A；6～7 min，90% A；7～7.5 min，90%～20% A。

1.2.1.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源（electrospray ion source，ESI）；掃描方式：正離子掃描；鞘氣流量：35 arb；輔助氣流量：6 arb；噴霧電壓：4.8 kV；毛細管溫度：350 ℃；毛細管電壓：30 V；透鏡電壓：55 V；分辨率：60 000；HCD相對碰撞能量：23%；鞘氣、輔助氣、C-trap碰撞氣類型：氮氣。

1.2.2 樣品前處理

由于AZAs在貝類的肌肉和內臟等組織中的富集程度各不相同，如AZA-1主要分布于消化腺，而AZA-3則主要分布于消化腺以外的其他組織[3]，因此在取樣時，應取除外殼的整個部分（包含肌肉和內臟）作為試樣，以確保樣品的均一性和代表性。

1.2.2.1 試樣制備

用尖銳物品將試樣去殼，將沙土及其他固體顆粒用清水沖洗去掉，瀝干后稱取200 g洗凈的樣品，置于潔凈的密封袋中，放入－20 ℃的冰箱中保存，避免試樣間的交叉污染。

可直接食用的樣品直接稱取即可。

1.2.2.2 提取和凈化

準確稱取制備好的試樣10 g（精確至0.01 g）于均質杯中，分別加入25 mL 85%乙腈-水提取液，5 g無水硫酸鎂和2 g氯化鈉，在20 000 r/min條件下均質60 s，用微纖維濾紙過濾，取10 mL濾液至離心管中，加入0.5 g C18基質固相分散萃取凈化劑和1 g無水硫酸鎂，旋渦振蕩1 min，7 000 r/min離心5 min，取5 mL清液移至錐形瓶中，40 ℃條件下旋轉蒸發至近干，以0.8 mL乙腈和0.2 mL水溶解，旋渦振蕩30 s，過0.2 μm微孔濾膜，待儀器分析測定。

1.2.3 空白實驗及回收率實驗

選用不含上述3種原多甲藻酸貝類毒素的扇貝樣品，分別添加3個水平（50、75 μg/kg和100 μg/kg）的原多甲藻酸標準物質，按上述步驟進行實驗，計算回收率結果。

選取純水代替試樣，按照上述步驟進行空白實驗。

2 結果與分析

2.1 提取條件的選擇

經查閱相關文獻，原多甲藻酸貝類毒素是一類脂溶性聚醚化合物，易溶于甲醇、乙腈、乙酸乙酯等有機溶劑，實驗分別考察乙酸乙酯、甲醇、乙腈3種提取液的提取效率，結果表明，乙腈的提取效率相比較好。但由于貝肉中富含大量的蛋白質、氨基酸等雜質，使用100%乙腈進行提取時，會增加粗提液中干擾雜質的比例，給凈化步驟增加難度，因此，實驗還比較了85%乙腈-水體系的提取效果，結果表明，85%的乙腈-水體系的提取效果與乙腈體系相當，但更有利于凈化，見表2。

表2 加標量均為100 g/kg的牡蠣樣品在不同提取條件下3種AZAs的檢測結果（ =6）Table 2 Recovery of 3 AZAs extracted from oyster samples spiked at 100 g/kg by different methods under different conditions ( =6) μg/kg

常見的樣品提取方式主要有振蕩提取、均質提取、超聲提取等，實驗分別考察不同提取方式對提取的影響，且在同一條件下，還考察了提取時間和溫度的影響，結果表明，均質提取的效果較好，延長提取時間在一定程度上能夠幫助提高提取效率，提取溫度對效率的影響不顯著，見表2。

通過正交試驗最終確定了前處理條件，室溫條件下，以乙腈-水溶液作為提取液，采用高速均質儀器將樣品均質60 s，待凈化。

2.2 分散劑和鹽的用量對提取效率的影響

QuEChERS凈化技術是一種通用性強、快速且簡便的前處理方法，近幾年來被廣泛應用于農藥殘留、獸藥殘留、毒素等檢測中[17-22]，本實驗以貝類樣品的基質特點為基礎，參照QuEChERS的基本原理進行了改進，并得到了較為滿意的結果。

圖1 MgSO4加入量（A）和NaCl加入量（B）對4種貝類產品基質中AZA-1提取效率的影響Fig.1 Effects of the amounts of added MgSO4and NaCl on extraction efficiency of AZA-1 in 4 shellfish matrixes spiked at 100 ?g/kg

為了幫助提高提取效率，實驗加入了無水硫酸鎂和氯化鈉。無水硫酸鎂能夠幫助目標化合物在提取溶液中更好的分散，使提取更加容易；氯化鈉則能夠使溶液體系中的水趨于相飽和，促使目標化合物分散至有機相并有助于水和乙腈相分層，從而提高提取效率[23-27]。實驗分別考察了無水硫酸鎂和氯化鈉的加入量對提取效率的影響，結果表明，5 g無水硫酸鎂和2 g氯化鈉的加入即能夠獲得較好地提取效率，見圖1。

2.3 凈化方式的選擇

本實驗采用了基質固相分散萃取技術進行凈化處理，分析比較Florisil、C18、N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、石墨化碳黑（graphitized carbon blacks，GCB）等幾種常用凈化劑的凈化效果[28-34]，Florisil作為強極性吸附劑，無法去除提取液中的脂類雜質，AZAs的回收率偏低；GCB通常用于去除色素成分，因其可吸附較強的帶苯環官能團的化合物[35]，且AZAs的結構中含有大量苯環，因此3種AZAs的回收率小于40%；PSA能有效去除基質中的脂肪酸和甾醇類基質，但考慮到PSA作為堿性吸附填料對酸性化合物有較強吸附作用，AZAs恰好屬于酸性化合物，因此吸附較為牢固，若要使用該類型的凈化劑，提取時需添加一定的酸以減少損失[36]；C18可有效去除脂類、糖類等親脂型雜質，對AZAs這類化合物的適用性較好，但過量的C18也會吸附目標化合物而使回收率降低，因此，需要對C18凈化劑的使用量進行優化。幾種凈化劑各有特點，需要在檢測靈敏度、最佳凈化效果和合理回收率之間尋求平衡點。因此，實驗通過優化最終確定了使用C18凈化劑（按照實驗確定的最終前處理步驟，每20 g樣品加入1 g凈化劑），并配以1 g無水硫酸鎂可以達到較好的凈化效果。

2.4 色譜條件的優化

圖2 3種AZAs的參考色譜圖Fig.2 Chromatograms of three AZAs standards

為了獲得目標化合物最好的色譜分析效果，考察了乙腈-水和甲醇-水兩種混合溶劑體系作為流動相時目標化合物的色譜行為。結果表明，使用甲醇-水體系作為流動相時，85%以上比例的甲醇才可將目標化合物洗脫下來，當甲醇比例達到90%時，3種原多甲藻酸貝類毒素就無法實現基線分離了，由于乙腈的洗脫能力較強，當采用乙腈-水體系作為流動相時，3種AZAs在7 min內可實現基線分離，見圖2。

2.5 質譜條件的確定

根據歐盟2002/657/EC指令，采用三重四極桿質譜儀的SRM模式對目標化合物進行確證需要至少兩個碎片離子，質譜儀屬于高分辨質譜儀，因此，僅需要一個高分辨母離子和一個高分辨子離子就可以滿足對目標化合物的確證要求。在本研究中，將全掃描模式的母離子作為定量離子，將峰豐度最高的HCD數據依賴性掃描碎片離子作為定性離子，并與理論值進行了對照，見表3。

本研究采用電噴霧離子源正離子模式，通過總離子流掃描可以看出，3種原多甲藻酸貝類毒素形成的準分子離子峰中[M＋H]＋峰豐度最高。采用HCD數據依賴性掃描得到多個碎片離子，形成的碎片離子中[M＋H－H2O]＋的響應最高，因此選作為定性離子，見圖3。

表3 AZA-1、AZA-2和AZA-3的質譜分析參數Table 3 UPLC-MS/MS parameters of AZAs-1, 2 and 3

圖3 扇貝樣品中添加水平為10 ?g/kg的3種AZAs參考二級質譜圖Fig.3 MS2fragmentation of 3 AZAs in scallops at spiked level of 10 ?g/kg

2.6 線性范圍、測定低限

3種原多甲藻酸貝類毒素采用基質曲線-外標法進行定量。用空白樣品提取液配制質量濃度為10～500 μg/L的混合標準溶液，以質量濃度為橫坐標（x，μg/kg）和定量離子對峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸計算，所得相關系數（R2）均大于0.99。根據10倍信噪比（RSN）確定化合物定量限（LOQ）。樣品中3種原多甲藻酸貝類毒素的LOQs均為10 μg/kg，表4列出了線性范圍、回歸方程、相關系數和LOQs。

表4 扇貝中AZAs的線性范圍、回歸方程、相關系數和LOQsTable 4 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients and LOQs for 3 AZAs spiked in scallops

2.7 精密度和回收率

經查閱，歐盟確立雙殼軟體動物中AZAs的最大允許限量為160 μg/kg[9]，實驗選用不含上述3種毒素的貝類產品及其制品為空白樣品，分3個水平進行添加回收實驗，每個添加水平進行6次重復實驗，分析并測定其精密度及回收率。3種AZAs在3個水平的添加回收率范圍均在76%～103%之間，相對標準偏差小于10%（n=6），滿足分析的要求，見表5。

表5 混合貝類樣品基質中3種AZAs的回收率和精密度（n =6）Table 5 Recovery ranges and precision of 3 AZAs in mixed shellfish matrixes (n = 6)

2.8 實際樣品測定

表6 17份樣品測定結果Table 6 Results obtained by the established method for the determination of AZAs in 17 samples μg/kg

采用研究建立的方法對共17份市售和進口貝類產品及其制品進行了測定，其中3份樣品檢出了AZAs，其中有一份樣本同時檢出了AZA-1和AZA-2，另外兩份只檢出AZA-1，但均未超過歐盟制定的安全限量標準，見表6。

3 3 結 論

研究結果表明，通過改進QuEChERS技術和基質分散固相萃取凈化技術可有效去除基質中的各類雜質，消除干擾，采用超高壓液相色譜-高分辨質譜測定貽貝、牡蠣、蚌類、扇貝等食用貝類及其制品中3種原多甲藻酸貝類毒素具有快速、準確、靈敏度高、重復性好、操作簡便等特點，本方法的測定低限能夠滿足國際上對該類項目的限量要求，適用于分析和測定食用貝類及其制品中原多甲藻酸類貝類毒素。

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Rapid Profiling and Confirmation of Azaspiracids in Edible Shellfishes by Ultra High Performance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry

HAN Shen, LIU Xin, LI Jian-hui, WANG Pei-yue, GU Jin, ZHANG Zhao-hui*
(Testing Center, Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Beijing 100026, China)

An ultra high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometric method (UHPLC-LTQ/ Orbitrap) was developed for the rapid profiling and confirmation of 3 natural azaspiracids (AZAs) (AZA-1, AZA-2 and AZA-3) in edible shellfishes including mussels, oysters, clams and scallops as well as related products. Samples were homogeneously extracted with acetonitrile-water. The diluted supernatants were then purif ed with a modif ed QuEChERS method. The separation was performed on an Acquity HSS T3 column (150 mm × 2.1 mm, 1.8 μm) by gradient elution with acetonitrile in water containing 5 mmol/L ammonium acetate and 0.1% formic acid. The high-resolution mass spectrometry was carried out by means of electrospray ionization in positive ion mode (ESI＋). The AZAs were detected by high-resolution MS under full scan and data-dependent scan modes, respectively. The limits of quantif cation (LOQ, RSN> 10) were 10 μg/kg for all the 3 AZAs. The calibration curves showed good linearity within the concentration range of 10 μg/L to 500 μg/L with correlation coeff cients (R2) more than 0.99. Shellf sh samples from home and abroad were prof led and conf rmed by the established method. AZAs were found in some samples. Therefore this method is easy, sensitive, reproducible and eff cient, and can be applied to prof le and conf rm AZAs in edible shellf shes and related products.

azaspiracids shellf sh toxins; high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry; QuEChERS

O657.6

A

1002-6630（2014）04-0116-06

10.7506/spkx1002-6630-201404024

2013-03-25

國家質檢總局科技計劃項目（2011IK193；2012IK145）；國家質檢總局質檢行業公益性科研專項（201210029）

韓深（1981—），男，工程師，本科，研究方向為食品安全檢測。E-mail：hansh@bjciq.gov.cn

*通信作者：張朝暉（1968—），男，高級工程師，博士，研究方向為食品安全檢測。E-mail：zhangzhh@bjciq.gov.cn