響應面法優化堿性蛋白酶酶解草魚蛋白質

石 嶺，趙 利*，袁美蘭，蘇 偉，劉 華，陳麗麗，溫慧芳

（江西科技師范大學生命科學學院，國家淡水魚加工技術研發分中心（南昌），江西 南昌 330013）

響應面法優化堿性蛋白酶酶解草魚蛋白質

石 嶺，趙 利*，袁美蘭，蘇 偉，劉 華，陳麗麗，溫慧芳

（江西科技師范大學生命科學學院，國家淡水魚加工技術研發分中心（南昌），江西 南昌 330013）

用Alcalase堿性蛋白酶對草魚蛋白質進行酶解，比較酶的添加量、pH值、溫度、料液比以及酶解時間對草魚蛋白水解進程的影響，通過響應面法優化Alcalase堿性蛋白酶酶解反應的工藝條件。結果表明：Alcalase堿性蛋白酶酶解草魚蛋白質的最優工藝條件為：加酶量1.8%、酶解溫度55 ℃、酶解pH 9.0、料液比1∶15、酶解時間180 min，此條件下蛋白質水解度達到23.46%。

草魚蛋白；酶解；響應面

我國是世界漁業大國，淡水魚產量已經連續20年居世界第一。近年來隨著我國淡水魚產品出口量逐年增加，淡水養殖的發展空間更加廣闊。但同時淡水魚產品中還存在著加工利用率低，低附加值產品多，深加工產品少等現象。魚蛋白質經酶解后得到的水解物，其溶解性、乳化性、起泡性和流變性等物理特性得到明顯改善[1-2]，且水解液中氨基酸種類齊全[3]，礦物質含量豐富，其中不同長度的肽段具有促進氨基酸、礦物質元素的吸收[4-5]、調節脂肪代謝[6-7]、降血壓[8-12]、抗疲勞[13-14]和抗氧化[15-20]等生理功能。本研究采用Alcalase堿性蛋白酶水解草魚蛋白，通過Box-Behnken試驗以及響應面分析，優化Alcalase堿性蛋白酶酶解草魚蛋白的條件，為淡水魚資源的精深加工利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚 樂買佳超市；Alcalase堿性蛋白酶(200000U/mL)諾維信生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

微波耦合酶反應器 江南大學；JJ-2高速組織搗碎機 上海標本模型廠；TDL-5A離心機 上海菲恰爾分析儀器有限公司；DELTA-320 pH計 美國梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 草魚魚肉成分的測定

水分含量：GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》；蛋白質含量：GB 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》；灰分：GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》；脂肪含量：GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》。

1.3.2 草魚蛋白的酶解工藝流程

新鮮魚→宰殺→清洗→采肉→絞碎→取肉→調節溫度和pH值→加酶水解→滅酶→離心取上清液→噴霧干燥

1.3.3 草魚蛋白質酶解

1.3.3.1 料液比對蛋白質水解進程的影響

稱取魚肉180、225、300、450、900 g，分別加入4 500 mL水于酶反應器中，即固液比為1∶25、1∶20、1∶15、1∶10、1∶5，攪拌混勻，調節水浴溫度為55 ℃，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH 8.5，待底物溫度上升至設定溫度，加入魚肉蛋白質質量3%的Alcalase堿性蛋白酶進行反應，反應過程中用1 mol/L氫氧化鈉溶液恒定體系pH值。酶解3 h后95 ℃滅酶5 min，離心取上清液，每個水平分別重復3次。

1.3.3.2 pH值對蛋白質水解進程的影響

稱取魚肉300 g，加入4 500 mL水于酶反應器中。調節水浴溫度為55 ℃，同時調節體系pH值，分別使底物在pH值為7.5、8.0、8.5、9.0、9.5條件下酶解，其余條件同1.3.3.1節。

1.3.3.3 溫度對蛋白質水解進程的影響

稱取魚肉300 g，加入4 500 mL水于酶反應器中。調節體系pH值為8.5，調節水浴溫度分別為45、50、55、60、65 ℃；其余條件同1.3.3.1節。

1.3.3.4 加酶量對蛋白質水解進程的影響

分別稱取魚肉300 g，加入4 500 mL水于酶反應器中。調節體系pH值為8.5，調節水浴溫度為55 ℃；向底物中分別加入質量分數0.5%、1%、1.5%、2%、3%、6%的Alcalase堿性蛋白酶，其余條件同1.3.3.1節。

1.3.3.5 酶解時間對蛋白質水解進程的影響

稱取魚肉300 g，加入4 500 mL水于酶反應器中。調節體系pH值為8.5，調節水浴溫度為55 ℃；向底物中加入蛋白質質量1% Alcalase堿性蛋白酶，反應過程中用1 mol/L氫氧化鈉溶液恒定體系pH值。當反應體系的pH值幾乎不再改變時，停止反應，95 ℃滅酶5 min，離心取上清液。

1.3.4 響應面試驗設計

應用Box-Behnken試驗設計原理，在單因素試驗確定的最佳試驗因素水平的基礎上進行響應面試驗，采用Design Expert v7.1.6軟件對試驗結果進行優化以及結果分析。

1.3.5 水解度的測定

水解度(degree of hydrolysis，DH)的計算采用pH-state 法并參照袁斌等[21]的方法。

式中：h為每克蛋白質水解肽鍵的物質的量/mmol；V為所消耗的NaOH體積/mL；Nb為NaOH的濃度/(mmol/mL)；mp為底物中蛋白質質量/g；htot為每克蛋白質中肽鍵的物質的量/mmol，對草魚蛋白而言，該值取8.6 mmol[22]；α為氨基的平均解離度。

2 結果與分析

2.1 草魚魚肉基礎成分

表1 草魚魚肉的化學成分Table 1 Chemical composition of grass carp meat

草魚魚肉的基礎成分如表1所示，以干質量計，草魚魚肉蛋白質含量為86.86%、脂肪含量為5.22%，草魚魚肉蛋白質含量高脂肪含量低，是一種優質的蛋白質資源。

2.2 Alcalase堿性蛋白酶水解單因素試驗

2.2.1 料液比對水解度的影響

圖1 料液比對水解度的影響Fig.1 Effect of liquid-to-material ratio on degree of hydrolysis

由圖1可知，隨著底物添加量的減小，水解度總體呈下降趨勢。因為底物添加量較低時酶與底物結合的幾率較小，故水解度會降低。增大底物添加量時水解度會相應的提高；但當底物添加量過大時蛋白溶液的黏度又會增大，使得流動性變差，不利于操作。因此最終選擇料液比為1∶15較為適宜。

2.2.2 pH值對水解度的影響

圖2 pH值對水解度的影響Fig.2 Effect of pH on degree of hydrolysis

由圖2可知，隨著pH值的增加，水解度呈上升趨勢；當pH值超過8.5時，水解度上升比較緩慢，這是因為Alcalase堿性蛋白酶對堿性環境有較強的適應性，所以溶液的pH值升高，水解度也會相應的提高。但是由于溶液堿性越大，反應后中和水解液時產生的鹽就越多，這將給后續的處理帶來不便，所以選pH 8.5作為最優條件。

圖3 溫度對水解度的影響Fig.3 Effect of temperature on degree of hydrolysis

2.2.3 溫度對水解度的影響由圖3可以看出，當溫度在45～55 ℃時，水解度隨著溫度的升高而增加；當溫度達到55 ℃時，水解度達到最大值25.02%；當溫度超過55 ℃時，水解度開始下降。溫度升高可以提高酶的活性，且有利于底物折疊結構的展開；當溫度繼續升高，超過了酶的最適宜溫度時，酶逐漸失活，導致蛋白質水解度下降[23]。

2.2.4 蛋白酶添加量對水解度的影響

圖4 加酶量對水解度的影響Fig.4 Effect of enzyme/substrate ratio on degree of hydrolysis

由圖4可知，蛋白質的水解度會隨著Alcalase堿性蛋白酶添加量(質量分數)的增多而增大，但當Alcalase堿性蛋白酶的添加量超過蛋白質質量的2%時，水解度的增加曲線趨于平緩，所以選擇2%為最優條件。又由于在工業生產中出于成本核算的考慮，酶用量一般不超過2%，故后續實驗中堿性蛋白酶添加量以2%為上限。

2.2.5 酶解時間對水解度的影響

圖5 酶解時間酶解對水解度的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on degree of hydrolysis

由圖5可知，水解度會隨著酶解時間的延長而增大，水解曲線呈先快速上升后緩慢上升的的趨勢，當時間達到180 min時，蛋白酶基本和蛋白質完全作用，繼續水解底物濃度會繼續減小，隨著水解的進行酶的特異性催化位點減少，即水解過程中酶逐漸失活[24]。同時產生的多肽會與草魚蛋白競爭作為Alcalase堿性蛋白酶的反應底物，從而進一步抑制蛋白酶的水解作用[25]。考慮到隨著酶解時間的延長成本會增加，所以選擇180 min作為最佳條件。

2.3 Alcalase堿性蛋白酶酶解反應的響應面試驗

根據單因素試驗結果，選擇對草魚蛋白水解度影響較大的3個因素：pH值（A）、溫度（B）、加酶量（C）為考察對象，以水解度DH（Y）為指標，采用Design Expert v 7.1.6軟件進行響應面試驗。試驗的因素水平如表2所示。

表2 Alcalase堿性蛋白酶酶解草魚蛋白響應面試驗因素水平表Table 2 Factors and their coded levels tested in response surface analysis

表3 Alcalase堿性蛋白酶酶解草魚蛋白響應面試驗設計及結果Table 3 Experimental design and results for response surface analysis

表4 響應面二次模型方差分析Table 4 Analysis of variance for the developed regression model

圖6 各因素及交匯作用對水解度的影響Fig.6 Response surface plots for the effects of factors and their interactions on degree of hydrolysis

通過統計分析軟件Design Expert v 7.1.6進行數據分析，建立二次響應面回歸模型為：DH＝21.38＋2.02A＋0.43B＋1.67C－0.87AB＋0.027AC＋0.66BC－0.31A2－0.91B2－1.34C2，回歸分析與方差分析結果見表3，交互作用的響應面分析見圖6。由表4可知，方程因變量與自變量之間的線性關系明顯，該模型回歸顯著(P＜0.000 1)，失擬項不顯著，且該模型說明該模型與實驗擬合良好，自變量與響應值之間線性關系顯著，可用于該反應的理論推測。在此基礎上優化Alcalase堿性蛋白酶最佳酶解條件參數為：加酶量1.8%、酶解溫度55 ℃、酶解pH 9.0，預測水解度為23.62%，在此條件下酶解180 min，蛋白水解度為23.46%。所以說明響應面的實驗值與回歸方程預測值基本吻合，建立的模型可以對實際工藝進行預測。

3 結 論

以水解度為指標，通過單因素試驗確定Alcalase堿性蛋白酶酶解草魚蛋白的料液比、pH值、溫度、加酶量的最適范圍。采用Design Expert v7.1.6軟件，通過Box-Behnken試驗得到水解度與p H值（A）、溫度（B）、加酶量（C）關系的回歸模型，回歸方程為：DH＝21.38＋2.02A＋0.43B＋1.67C－0.87AB＋0.027AC＋0.66BC－0.31A2－0.91B2－1.34C2。Alcalase堿性蛋白酶酶解草魚蛋白的最佳酶解工藝為：加酶量1.8%、酶解溫度55 ℃、酶解pH 9.0、料液比1∶15、酶解時間180 min，蛋白質水解度達到23.46%。本實驗采用Alcalase堿性蛋白酶酶解草魚蛋白，研究了響應面優化酶解工藝，而酶解產生的多肽的分離純化以及結構功能仍有待進一步的研究。

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Optimizing Conditions for Alcalase-Catalyzed Hydrolysis of Grass Carp Protein by Response Surface Methodology

SHI Ling, ZHAO Li*, YUAN Mei-lan, SU Wei, LIU Hua, CHEN Li-li, WEN Hui-fang
(National R&D Branch Center for Freshwater Fish Processing, College of Life Science, Jiangxi Science and Technology Normal University, Nanchang 330013, China)

This study aimed to optimize the conditions for enzymatic hydrolysis of grass carp proteins. Alcalase was used to hydrolyze grass carp proteins. The effects of enzyme/substrate ratio, pH value, temperature, material/liquid ratio and hydrolysis time on the degree of hydrolysis were analyzed. Box-Behnken design (BBD) and response surface methodology (RSM) were adopted to obtain the optimum hydrolysis conditions on the basis of results of single-factor experiments. The degree of hydrolysis of 23.46% was obtained under the optimum hydrolysis conditions of 1.8%, 55 ℃, 1:15, 180 min and 9.0 for enzyme/substrate ratio, temperature, material/liquid ratio, hydrolysis time, and pH, respectively.

grass carp protein; enzymatic hydrolysis; response surface methodology

TS254.4

A

1002-6630（2014）04-0026-04

10.7506/spkx1002-6630-201404006

2013-04-25

江西省高等學校科技落地計劃項目（KJLD12009）

石嶺（1989—），男，碩士研究生，研究方向為食品化學。E-mail：839066518@qq.com

*通信作者：趙利（1967—），女，教授，博士，研究方向為食品化學。E-mail：lizhao618@hotmail.com