湖南芥菜腌制發酵過程中的菌相變化規律

王一淇，李宗軍*

（湖南農業大學食品科學與技術學院， 湖南 長沙 410028）

湖南芥菜腌制發酵過程中的菌相變化規律

王一淇，李宗軍*

（湖南農業大學食品科學與技術學院， 湖南 長沙 410028）

從動態角度研究湖南芥菜發酵過程中6種菌相階段性變化，為其實現從自然發酵到人工發酵提供科學依據。結果表明：芥菜發酵主要分為3個階段。第1階段發酵液pH＞5.0，細菌總數、腸道桿菌及酵母菌數量先下降后上升，乳酸球菌為優勢菌種，數量達到106CFU/g；第2階段發酵液pH值降至5.0以下，細菌總數、腸道桿菌及酵母菌數量在一個數量級內上下波動，分別為105、104、105，乳酸桿菌成為優勢菌種，數量級為106，球菌為105；第3階段發酵液pH＜4.0，細菌、酵母菌和乳酸菌的數量開始明顯減少，腸道桿菌生長基本受到抑制，乳酸桿菌仍是優勢菌種，數量級在 104。醋酸菌數量一直處于一個非常低的水平。為實現芥菜的自然發酵到人工發酵，可以用乳酸球菌和乳酸桿菌組合當發酵劑，并且適當降低發酵初始pH值。

芥菜；發酵；菌相變化

大約3000年前，我國就有了發酵蔬菜的制作工藝，如四川泡菜、榨菜、揚州醬菜等。傳統發酵蔬菜是我國蔬菜加工產品中產量最多的一種[1]。傳統的蔬菜腌制是利用高鹽濃度的滲透作用及乳酸菌在蔬菜中的生長代謝，利用乳酸發酵賦予腌菜特有風味。但目前，一些地區蔬菜腌制產品工藝依然停留在自然發酵水平。其發酵周期長，生產過程不易控制及易引起環境污染等一系列問題，腌制過程中的雜菌尤其是硝酸鹽還原菌，能夠產生亞硝酸鹽等對人體有害的物質，導致腌菜企業難以實現標準化、規模化生產[2]。同時由于消費者對食品安全和健康的追求，迫切需要發酵蔬菜低鹽、低亞硝酸鹽含量的產品，實現加工標準化、規模化。人工發酵蔬菜正好可以滿足人們的這些要求。本實驗針對湖南芥菜加工現狀，檢測其發酵過程中的菌相變化，為實現自然發酵到人工發酵提供科學依據[3-4]。

1 材料與方法

1.1 材料與培養基

1.1.1 芥菜品種

芥菜來自湖南省長沙市黃興鎮。

1.1.2 培養基

PCA（plate count agar）培養基（培養細菌用）：胰蛋白胨5.0 g/L、酵母浸粉2.5 g/L、葡萄糖1.0 g/L、瓊脂15 g/L，pH7.0，121 ℃滅菌20 min。

MRS培養基（g/L，培養乳酸桿菌用）：蛋白胨10、牛肉膏10、酵母提取物5、K2HPO42、檸檬酸二銨2、乙酸鈉5、葡萄糖20、MgSO4·7H2O 0.58、MnSO4·4H2O 0.25、瓊脂15、吐溫-80 1 mL/L，pH6.2～6.4，121 ℃滅菌20 min。

M17培養基（g/L，培養乳酸球菌用）：大豆蛋白胨5.0、蛋白胨2.5、酪蛋白胨 2.5、酵母浸粉2.5、牛肉浸粉5.0、乳糖5.0、抗壞血酸0.5、β-甘油磷酸二鈉19、瓊脂15，pH7.1，121 ℃滅菌20 min。

McConkey培養基（g/L，培養腸道桿菌用）：蛋白胨20、牛膽鹽5、氯化鈉5、乳糖10、結晶紫0.001、中性紅0.025、瓊脂15，pH6.2～6.4，121 ℃滅菌20 min。

MEA（Malt Extract Agar）培養基（g/L，培養酵母菌用）：麥芽膏粉130、氯霉素0.1、瓊脂15，121 ℃滅菌20 min。

DMS（deoxycholate mannitol sorbitol）培養基[5-6]（g/L，培養醋酸菌用）：蛋白胨10、酵母提取物3、乳酸鈣 15、葡萄糖1、山梨糖醇1、甘露糖1、磷酸鉀1、脫氧膽酸鈉0.1、硫酸鎂0.02、溴甲酚0.03、放線菌酮0.1、瓊脂 18，pH4.5，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

超凈工作臺 安徽蚌埠市瑞風凈化設備工程；電熱恒溫培養箱 上海新苗醫療器械制造有限公司；酸度計中國杭州雷磁分析儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 發酵工藝流程

芥菜 →切碎→撒鹽（質量分數10%的鹽）→裝袋→密封→保溫發酵1 d→小袋分裝→密封→恒溫20 ℃發酵

1.3.2 取樣

在發酵第0、5、10、15、20、30、45、60、75、90天取樣，每次取1小袋（約500 g）樣品進行檢測。

1.3.3 微生物指標測定

采用稀釋平板計數法：無菌稱取25 g樣品于裝有225 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，制成10-1稀釋液后于試管內進行梯度稀釋，稀釋至適宜度數進行以下各種微生物的分離培養與計數。

細菌總數的測定：傾注PCA培養基，37 ℃培養48 h計數，由于乳酸菌在PCA生長微弱，所以細菌總數不包括乳酸菌的數量。乳酸桿菌的測定：傾注MRS培養基，37 ℃培養48 h計數。乳酸球菌的測定：傾注M17培養基，37 ℃培養48 h計數。腸道桿菌屬的測定：傾注McConkey培養基，37 ℃培養48 h計數。酵母菌的測定：傾注MEA培養基，30 ℃培養48 h計數。醋酸菌的測定：傾注DMS培養基，30 ℃培養48 h計數。

1.4 數據處理

運用PASW Statistics Base 18分析，數據用±s表示。

2 結果與分析

2.1 芥菜自然發酵過程中pH值的變化

圖1 芥菜發酵過程中pH值的變化Fig.1 pH change during the fermentation process of Chinese leaf mustard

由圖1可知，芥菜在自然發酵過程中，隨著發酵時間的延長，有機酸累積、pH值逐漸下降，發酵前期（0～15d）pH值一直維持在5.0以上，發酵中期（15～60d）pH降到了5.0以下；發酵后期（60～90d），

pH值降到了4.0以下，并維持在一個較低值。

2.2 芥菜自然發酵過程中酵母菌及腸道桿菌總數的變化

圖2 芥菜發酵過程中腸道桿菌總數、酵母菌總數的變化Fig.2 Change in the amounts of Enterobacteriaceae and yeast duringthe fermentation process of Chinese leaf mustard

由圖2可知，芥菜發酵過程中，其自帶的大量酵母菌，在鹽含量10%的環境中，數量略有下降，之后在發酵過程中酵母菌總數都保持在5（lg（CFU/g）），說明在芥菜自然發酵微生物區系中，酵母菌對整個發酵過程起了重要作用。pH值在4.0以上的變化對酵母菌總數影響不大，但pH值低于4.0時，酵母菌生長受到抑制，降到了4（lg（CFU/g））。芥菜自帶大量腸桿菌。在高鹽濃度環境下，其數量在第5天明顯下降。由于自然發酵雜菌混多，導致產酸慢，到第60天的過程中，腸道桿菌數一直處于相對穩定的4（lg（CFU/g））內。pH值降到4.0以下時，基本上抑制了其生長，在稀釋10倍的平皿上已經檢測不到腸道桿菌的存在。

圖3 芥菜發酵過程中細菌總數的變化Fig.3 Change in the amount of total bacteria during the fermentation process of Chinese leaf mustard

2.3 芥菜自然發酵過程中細菌總數的變化由圖3可知，芥菜自然發酵過程中，細菌總數基本處于一個下降的過程。第5天數量略為下降，第10天其數量達到峰值6.8（lg（CFU/g））；在第15～60天，細菌總數保持在

5（lg（CFU/g）），這是由于在發酵的初期，環境中營養物質還比較豐富，酸度還不是很大，使得微生物類群大量生長；到了發酵中后期，厭氧或兼性厭氧的乳酸菌在各菌相中占據了優勢，pH＜4.0時，細菌總數大部分被抑制住，總數明顯下降，第90天降至3.75（lg（CFU/g））。

2.4 芥菜自然發酵過程中乳酸球菌與乳酸桿菌總數的變化

圖4 芥菜過程中乳酸球菌總數、乳酸桿菌總數的變化Fig.4 Change in the amounts of Lactobacillus and Lactococcus during the fermentation process of Chinese leaf mustard

由圖4可知，在芥菜自然發酵過程中，乳酸菌生長可分成3個階段。發酵前期（0～15d），主要是乳酸球菌處于優勢地位， pH值維持在5.0以上，乳酸球菌具有繁殖快、耐酸性差的特點；發酵中期（15～60d），pH值下降到5.0以下，這時乳酸球菌的活動受到抑制，桿菌數量始終高于球菌，球菌的數量在5（lg（CFU/g））開始有下降趨勢；發酵到第60天，pH值降至4.0，乳酸桿菌數量達到峰值6.86（lg（CFU/g）），乳酸球菌的數量因桿菌的生長和pH值的變化受到抑制，數量開始顯著下降；發酵后期（60～90d），pH＜4.0，乳酸球菌的數量大量減少，桿菌的生長在后期因營養物質減少，代謝物質的增加，數量也開始明顯減少，但仍大量存在。

2.5 芥菜自然發酵過程中醋酸菌總數的變化

圖5 芥菜發酵過程中醋酸菌的總數變化Fig.5 Change in the amount of acetic acid bacteria during the fermentation process of Chinese leaf mustard

由圖5可知，芥菜在未發酵前自帶一定量的醋酸菌，但在高鹽厭氧環境中，醋酸菌數量迅速下降，在稀釋10倍的樣品中已經檢測不到醋酸菌的存在。說明在芥菜的發酵過程中，醋酸菌的作用甚微。

3 討 論

蔬菜發酵是中國保藏食品傳統方法之一，因其具有獨特的風味所以流行至今。慢慢人們發現發酵蔬菜的未來市場廣闊[7]，但其發酵周期長，難以實現工業化生產；同時人們也開始意識到自然發酵蔬菜處理不當[8]，存在許多健康隱患，如亞硝酸鹽含量高等。于是大量的研究開始針對各種發酵蔬菜其微生物組成，大多研究[9-10]是對已經腌制好的成品進行分析，并從中分離優勢菌種來作為后期研究，這些樣品具有較高酸度，所以分離出的優勢菌種大多為乳酸桿菌。

本實驗是利用微生物培養的方法，從一個動態的角度，完整的觀察了蔬菜發酵不同階段的菌相變化。這樣不僅是為了分離出優良的發酵劑菌種，還為了了解芥菜發酵過程中優勢菌種的變化以及其對不同發酵階段的意義，為選擇發酵菌種提供依據。本實驗針對發酵蔬菜中普遍存在的幾大菌群進行了動態數量分析。

3.1 乳酸球菌與乳酸桿菌

由本實驗結果可知，前期以乳酸球菌為主要優勢菌和后期主要以乳酸桿菌來完成發酵，結合乳酸球菌不耐酸和桿菌耐酸能力強等特點，以及參考相關文獻，此結果與前人所研究的結果是一致的。關倩倩[11]對泡菜自然發酵過程中的菌系結構進行了研究，得出在此過程中，乳酸菌總數在起始發酵階段相對較少，為2.19（lg（CFU/mL）），在發酵中期才成為優勢菌。值得提出的是，包括上述這份報道在內的國內關于我國傳統泡菜乳酸菌的研究中，乳酸菌在初期并不是優勢菌種。而本研究中，蔬菜本身自帶大量的乳酸菌，而且在發酵前中階段，乳酸菌就一直屬于優勢菌種。除此之外，在本實驗中，乳酸球菌與桿菌的數量雖始終有個數量級的落差，但是整體上是同升同降，并不存在桿菌的大量繁殖而抑制球菌的數量的現象[4]。出現這些不同結果的原因可能有兩種：1）樣品表面附著的菌系結構會因蔬菜種類，地區，氣候等因素的不同而產生差異；2）發酵蔬菜在腌制過程中，會因為操作、鹽度、溫度的不同也會導致微生物群的差異。

3.2 酵母菌

酵母菌作為發酵過程中不能忽視的一大類菌。酵母菌可以從蔬菜的本身帶來，也可以從腌制工具和空氣中來[3]。它參與發酵，給予發酵蔬菜特殊的風味。但是大量的繁殖也會帶給腌制品不愉快的酸臭味，導致腌制品變質。有研究[12]表明，在運用變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）分析發酵蔬菜中的菌相變化中，發酵性酵母可在整個主發酵及二次發酵階段生長，酵母的數量變化主要由發酵pH值階段變化來決定，這與本實驗的結果相一致。在本實驗中，在主要的發酵階段酵母的數量僅次于乳酸菌。這一結果表明，在湖南芥菜腌制過程中，酵母菌這一菌群也起著非常重要的作用。

3.3 腸道桿菌

腸道桿菌對于整個發酵屬于有害菌。根據施安輝等[3]的研究，蔬菜腌制中有害微生物的生長繁殖在pH4.5以下時是受到抑制的。其中大腸桿菌所能忍受的最低pH值為5.0～5.5。結合本實驗結果，在人工發酵芥菜中，在初始發酵時添加適當的酸來降低pH值，可以大量抑制發酵液中的有害菌，同時還能為乳酸菌提供更適的生長環境。

3.4 醋酸菌

在蔬菜發酵中普遍存在一些醋酸菌，其在好氧的條件下，把酒精轉化為醋酸[3]。適量的醋酸菌及其活動是對泡菜有利的[9]。對于醋酸菌的相關研究中[13]，常規篩選培養基具有黏度小、傾倒平板時用于產酸指示劑作用的碳酸鈣很容易在平皿底沉淀的特點，這樣導致上層碳酸鈣含量低，不利于好氧菌醋酸菌的的觀察。針對醋酸菌的分離培養，本實驗使用的是DMS培養基，不同于常規醋酸菌篩選培養基，其黏度適中，使用溴甲酚紫作為指示劑，其產生的變色反應能很好的觀察醋酸菌的生長。

3.5 細菌

傳統蔬菜腌制，利用的就是蔬菜自帶的細菌進行發酵，除了以上幾大菌群之外，發酵液中還存在大量的其他細菌。這一部分微生物組成相對復雜，但是其生長狀況對最后蔬菜品質存在重要意義。董玲[14]對四川傳統腌制的冬菜進行了細菌多樣性研究，發現其細菌主要由變形桿菌門、厚壁菌門和放線菌門組成，而其中芽孢桿菌對冬菜腌制成熟起重要作用。本實驗對于細菌總數的研究，意在觀察其與發酵階段以及其他幾大菌群的消長規律，結果表明：高鹽的環境能抑制一部分細菌的生長，但就整個發酵階段來看，其主要受發酵酸度變化的影響，與其他菌群消長關系不大。

根據以上研究分析，如果要實現湖南芥菜的工業化生產，在選擇發酵劑菌種時應選擇組合菌種發酵效果會比較好，可以用乳酸球菌和乳酸桿菌進行組合。因為這樣更接近它自然發酵的狀態，并且乳酸菌在發酵過程中產生大量有機酸，其既能抑制其他有害微生物的生長，還能提高產品的營養價值[15-16]。除此之外，可以在發酵初期添加適當的酸，降低其初始pH值到5.0左右，這樣可以有效抑制有害菌群的生長，同時也為乳酸菌提供更適合的生長環境，相信在一定程度上也可以縮短發酵周期以及降低亞硝酸鹽含量[17-18]。湖南芥菜是湖南本地人經常用來作為腌制酸菜吃的，基本融入了每家每戶的生活，通過發展發酵劑，期望能在保留原有風味的同時，讓人們吃得更方便和健康。

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Changing Patterns of Microflora during Natural Fermentation of Chinese Leaf Mustard (Brassica juncea coss) Grown in Hunan Province, China

WANG Yi-qi, LI Zong-jun*
(College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410028, China)

Dynamic changes in the numbers of six microbial populations at diffe rent stages of natural fermentation of Chinese leaf mustard (Brassica juncea coss) were investigated by microbial culture methods. The results showed that the fermentation process of Chinese leaf mustard included three stages: 1) the fermented juice was at a pH greater than 5.0, the numbers of total bacteria, Enterobacteriaceae and yeast were increased and subsequently decreased, and the dominant bacterium was Lactobacillus, reaching 106CFU/g; 2) the pH of fermented juice was reduced to below 5.0, the numbers of total bacteria, Enterobacteriaceae and yeast were fluctuated within orders of magnitude of 105, 104and 105, respectively, and Lactococcus became the dominant bacterium at an order of magnitude of 106, compared to 105for Lactobacillus; 3) the pH of fermented juice was further reduced to smaller than 4.0, the numbers of total bacteria and yeast began to significantly decline, the growth of Enterobacteriaceae was almost inhibited, and Lactococcus remained dominant at a level of 104, whereas acetic acid bacteria were always at very low levels. Artificial fermentation with a composite starter culture consisting of Lactobacillus and Lactococcus at appropriately low levels of initial pH may be an alternative to natural fermentation.

Chinese leaf mustard; fermentation; microf oral change

R151.3

A

1002-6630（2014）11-0200-04

10.7506/spkx1002-6630-201411040

2013-09-21

王一淇（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：wangyiqiice@163.com

*通信作者：李宗軍（1968—），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：hnlizongjun@163.com