1株高效降膽固醇乳酸菌的功能與發酵特性

靳志敏，通力嘎，段 艷，賈雪暉，劉夏煒，王德寶，靳 燁

（內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特 010018）

隨著人們生活水平的提高、肉品加工技術的不斷改進和冷藏工藝的出現，人們生活節奏的不斷加快，營養知識的逐漸普及，發酵香腸越來越受到人們的青睞[1]。羊肉作為一種優良的畜肉，在世界各國都有著悠久的食用歷史。同時，肉制品中含有大量的膽固醇，而血清中的膽固醇被認為是誘發冠心病、動脈粥樣硬化等心血管疾病的重要危險因素[2]。

自然界中乳酸菌大量存在于發酵制品中，國內外均有大量研究發現乳酸菌在體內降低血液中膽固醇含量1%，即可降低心血管病的發病率2%～3%[3]。大量研究發現人們經常食用發酵制品具有降低人體血清膽固醇的作用[4]。為此，人們對乳酸菌開展了體內外降解膽固醇研究，旨在開發功能性乳酸菌制品，滿足人們健康的需要。因此研究降膽固醇性能優良的菌株，對于開發功能性發酵制品、豐富現有發酵制品的種類、提高發酵制品的附加價值以及在食品加工中都具有重要的現實意義。

本實驗進一步研究經初步篩選得到的膽固醇降解率較好的乳酸菌的降膽固醇特性，為篩選性能優良的乳酸菌作發酵香腸發酵劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養基

菌株：內蒙古農業大學食品科學與工程學院保存的經初步篩選得到的1株具有降膽固醇性能的乳酸菌X3-2B；標準菌株：植物乳桿菌（L.plantarum，LP） 廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心，a2m1.191。

MRS-THIO培養基：MRS培養基中添加0.2 g/100 mL牛膽鹽和0.2 g/100 mL巰基乙酸鈉；膽固醇篩選培養基：MRS-THIO培養基中添加2%無菌膽固醇溶液（1.0 g/100 mL）[5]；模擬肉湯-CHOL培養基：模擬肉湯液體培養基中添加0.2 g/100 mL牛膽鹽和0.2 g/100 mL巰基乙酸鈉，121 ℃滅菌15 min后，添加2%無菌膽固醇溶液（1.0 g/100 mL）；MRS＋6 g/100 mL NaCl＋150 mg/kg NaNO2-CHOL培養基：MRS-THIO培養基中添加6 g/100 mL NaCl 和150 mg/kg NaNO2，121 ℃滅菌15 min后添加2%無菌膽固醇溶液（1.0 g/100 mL）。

1.2 試劑與儀器

牛膽鹽 廣東環凱微生物科技有限公司；巰基乙酸鈉 廣東環凱微生物科技有限公司；膽固醇 美國Sigma公司；BioSenTec Lot：28-12091膽固醇檢測試劑盒南京建成生物工程研究所。

ZHJH-C1214C超凈工作臺 南京依貝儀器設備有限公司；YXQ-LS-SⅡ立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；T6新世紀紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；胴體肌肉pH值直測儀 武漢恒綠食品技術有限公司；HD-3A型智能水分活度計測量儀 無錫市華科儀器儀表有限公司；TCP2型全自動測色色差計 北京奧依克光電儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株降膽固醇性能的測定

將各菌株于液體MRS培養基中活化3代后按2%接種量接于膽固醇篩選培養基中，培養24 h后于12 000 r/min離心10 min后，取上清液0.5 mL用鄰苯二甲醛比色法測定其膽固醇含量[6-8]。實驗重復3次取平均值。

1.3.1.1 不同溫度對膽固醇降解能力的影響

將菌株于液體MRS培養基中活化3代后按2%接種量接種于液體膽固醇篩選培養基中，分別于4、10、15、25、30、45 ℃培養24 h，以不接種培養基為對照測定其膽固醇含量，實驗重復3次取平均值，計算其膽固醇降解率[9]。

1.3.1.2 不同pH值對膽固醇降解能力的影響

將菌株于液體MRS培養基中活化3代后按2%接種量接種于pH 3.5、4.5、5.5、6.0的液體膽固醇篩選培養基中，培養24 h以不同pH值的不接種培養基為對照，測定其膽固醇含量，實驗重復3次取平均值，計算其膽固醇降解率[4]。

1.3.1.3 不同培養基中膽固醇降解能力

將菌株于液體MRS培養基中活化3代的菌株以2%接種量接種于液體膽固醇篩選培養基、模擬肉湯-CHOL培養基、MRS＋6 g/100 mL NaCl＋150 mg/kg NaNO2-CHOL培養基中[4]，培養24 h后測定其膽固醇含量，實驗重復3次取平均值，計算膽固醇降解率。

1.3.2 菌株在發酵香腸中的應用

以內蒙古蘇尼特羊后腿肉與背部脂肪按肥廋比為20∶80制作3組發酵香腸：第1組（對照組）：以環境中自然菌株做發酵劑；第2組：以X3-2B為發酵劑；第3組：以標準菌株LP為發酵劑。分別在發酵香腸0、3、6、9、14 d時測定各組發酵香腸乳酸菌數、細菌總數、水分活度、pH值、色差值，并用膽固醇檢測試劑盒測定其0、14 d時各組香腸膽固醇含量[10-11]。其中，色差：L*表示亮度，L*=100為白，L*=0為暗；L*值越大，色澤越白。a*＞0表示紅色程度，a*＜0表示綠色程度。b*＞0表示黃色程度，b*＜0表示藍色程度。

1.4 數據分析

用SPSS17.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的功能特性

2.1.1 不同培養溫度對菌株降膽固醇性能的影響

圖1 不同培養溫度對菌株膽固醇降解率的影響Fig.1 Cholesterol degradation efficiencies at different temperatures

由圖1可知，不同培養溫度對菌株膽固醇降解能力有一定影響，菌株在30 ℃時膽固醇降解能力與4、10、15 ℃條件下膽固醇降解能力差異顯著（P＜0.05），與25 ℃和45 ℃時膽固醇降解能力差異不顯著。在相對較低溫度（4、10、15 ℃）條件下培養的菌株其膽固醇降解能力差異不大，都為30%左右，30 ℃時菌株膽固醇降解能力最大。菌株在30 ℃時，生長能力較好及產酸能力較強，會產生游離膽酸，膽固醇和游離膽酸共沉淀，使膽固醇含量降低，而在溫度較低或較高時，菌株生長能力較弱，培養基中膽固醇略有下降是由菌體細胞的吸收作用引起的[12]。

2.1.2 不同酸度對菌株降膽固醇性能的影響

圖2 不同pH值對菌株膽固醇降解率的影響Fig.2 Cholesterol degradation efficiencies at different pH levels

由圖2可知，菌株X3-2B在培養基pH值為5.0、5.5、6.0時膽固醇降解能力顯著高于培養基pH值為3.5、4.5（P＜0.05）時，且當培養基pH 5.5時膽固醇降解能力最大。有研究[13-14]表明，乳酸菌在體外培養條件下，較低的pH值會提高其膽鹽水解能力，從而形成游離膽酸，與膽固醇發生共沉淀，從而降低膽固醇含量，但pH值太低會抑制菌株生長，從而pH 5.5時菌株膽固醇降解能力較好[15]。

2.1.3 不同培養基對菌株降膽固醇性能的影響

圖3 不同培養基對菌株膽固醇降解率的影響Fig.3 Cholesterol degradation efficiencies in different media

由圖3可知，不同培養基中同一菌株膽固醇降解率差異不顯著（P＞0.05），菌株X3-2B在不同培養基中膽固醇降解大于標準菌株LP在不同培養基中的膽固醇降解率，且各株菌在MRS培養基中膽固醇降解率最大。各培養基中營養成分的不同使得菌株在各培養基中生長能力不同，導致其在各培養基中的膽固醇降解能力不同。

2.2 乳酸菌在發酵香腸中的發酵特性

發酵肉制品是指腌制肉經過微生物發酵作用，產生特殊的風味、色澤和質地，并具有較長保存期的肉制品。發酵劑乳酸菌可降低pH值，減少腐敗，改善制品組織狀態，且具有降低膽固醇的益生功能。

2.2.1 菌株對發酵香腸中微生物的影響

由表1可知，各個時間段細菌總數與乳酸菌數差別不大，可知發酵香腸在發酵、成熟、干燥、貯藏等階段乳酸菌起著關鍵作用。在發酵香腸做作的相同階段，X3-2B組與LP組的乳酸菌數高于對照組，在發酵6 d時乳酸菌數分別為8.23、8.62（lg（CFU/g）），這與Ambrosiadis等[16]的研究結果相一致。通過接種發酵劑，使乳酸菌在發酵香腸中迅速生長。發酵期由于適宜的溫度、pH值和濕度，菌數總數與乳酸菌數迅速增高，隨著時間的延長，到干燥成熟期香腸低pH值、低溫和不斷降低的水分活度抑制了細菌的生長，成熟后期細菌總數均不斷降低。

表1 菌株對發酵香腸中微生物的變化Table 1 Variations in bacterial quantities in fermented sausages

2.2.2 菌株對發酵香腸水分活度、pH值的影響

表2 發酵香腸水分活度與pH值變化Table 2 Variations in aw and pH in fermented sausages

由表2可知，發酵香腸水分活度隨發酵時間的增加而逐漸減少，各實驗組不同天數之間水分活度差異顯（P＜0.05）。X3-2B組在發酵香腸各個階段其水分活度顯著低于對照組，水分活度下降速度較快。X3-2B組與LP組在加工各個階段其pH值顯著（P＜0.05）低于對照組，且X3-2B組在發酵結束階段（0～3 d）pH值速迅降低到4.7，然后緩慢增加，而LP組3～6 d時pH值速迅降低到5.0后緩慢增加，可知菌株X3-2B在肉品中的產酸性能優于標準菌株。發酵香腸水分活度的下降與pH值呈直線關系，且隨著發酵香腸pH值的降低，其水分活度也呈下降趨勢，但pH值對水分活度的影響較小[17]。故菌株X3-2B產酸性能優良，發酵迅速，能快速降低發酵香腸pH值。

2.2.3 菌株對發酵香腸色差的影響

由表3可知，不同實驗組在發酵3 d與6 d時色差值差異不顯著（P＞0.05），與對照組相比，加發酵劑組的發酵香腸a*值與b*值小于對照組，顏色更紅更飽滿。在對發酵香腸色澤的評價中，b*值的不同單純測定發酵香腸的a*值并不能完全評價人們的觀察結果，因此采用a*/b*值來比較紅色，更能貼切地反映出人們對紅色的感官評價。a*/b*值越大，表現出的紅色越鮮艷[18]。在發酵香腸制作的各個階段，各組發酵香腸明度值L*、紅度值a*與黃度值b*都呈先下降后增加的趨勢。

表3 發酵香腸色差變化Table 3 Variation in color parameters in fermented sausages

2.2.4 發酵香腸膽固醇含量

表4 發酵香腸膽固醇含量Table 4 Cholesterol content in fermented sausages mg/100 g

由表4可知，加發酵劑組的發酵香腸中膽固醇含量顯著降低（P＜0.05），而對照組中膽固醇含量無顯著變化，且標準菌株在肉中的膽固醇降解能力稍強于菌株X3-2B。這與Staji?等[19]制作的豬肉發酵香腸中膽固醇含量變化情況相吻合，其在第14天時各組發酵香腸膽固醇含量差異不顯著。在貯存28 d與56 d時，X3-2B組發酵香腸中膽固醇含量顯著降低（P＜0.05），到56 d時膽固醇含量為52.83 mg/100 g，LP組發酵香腸中2周后膽固醇含量沒有顯著性變化。在發酵香腸貯存56 d時，X3-2B組發酵香腸中膽固醇含量最低。工業生產中膽固醇含量一般在58.48～105.24 mg/100 g[19-20]之間，由此可知，菌株X3-2B對肉中膽固醇降解性能較優良。

3 結 論

菌株X3-2B在培養溫度為30 ℃，pH值為5.5時膽固醇降解能力最強。在不同培養基中，菌株膽固醇降解率大于標準菌株LP，且各菌株在MRS膽固醇培養基中的膽固醇降解率最大。

菌株X3-2B在發酵香腸加工適應溫度（15～25 ℃）、適應pH值（5.0～6.0）條件下，有較好的膽固醇降解率，且發酵香腸水分活度、pH值、色澤與乳酸菌數都優于對照組，在貯存56 d時發酵香腸膽固醇含量低于對照組與LP組。

綜上所述，菌株X3-2B降膽固醇性能、功能特性與發酵特性優良，故可作為1株功能、發酵特性優良的肉制品發酵劑。

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