α-松油醇對意大利青霉的抑制作用

歐陽秋麗，賈 雷，陶能國*，何湘麗

（湘潭大學(xué)化工學(xué)院，湖南 湘潭 411105）

α-松油醇對意大利青霉的抑制作用

歐陽秋麗，賈 雷，陶能國*，何湘麗

（湘潭大學(xué)化工學(xué)院，湖南 湘潭 411105）

測定α-松油醇對意大利青霉菌絲體形態(tài)及菌絲體生長的影響，并對其抑菌機制進行初步探討。結(jié)果表明：α-松油醇能明顯抑制意大利青霉菌絲體生長，最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）和最小殺菌濃度（minimal fungicidal concentration，MFC）分別為2.00 μL/mL和8.00 μL/mL；經(jīng)MIC和MFC α-松油醇處理后，意大利青霉菌絲體胞外pH值、胞外電導(dǎo)率及260 nm條件下吸光度顯著增加，總脂質(zhì)含量有顯著下降。提示α-松油醇能改變細胞膜的通透性、破壞細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，導(dǎo)致胞內(nèi)成分泄露，從而抑制意大利青霉菌絲體生長。

α-松油醇；意大利 青霉；細胞膜；抑制作用

意大利青霉（Penicillium italicum）引起的青霉病是柑橘主要貯藏期病害之一，每年造成大量的經(jīng)濟損失[1]。由于化學(xué)殺菌劑易帶來食品安全，以及病原菌對化學(xué)殺菌劑抗性不斷增強等問題，植物精油等生物防治法逐漸成為采后柑橘病害的替代方案[2]。Caccioni等[3]發(fā)現(xiàn)向液體培養(yǎng)基中添加250～5 000 μL/L甜橙、酸橙、寬皮柑橘、葡萄柚和枳橙精油能不同程度地抑制意大利青霉菌絲體生長，其中枳橙精油的抑菌效果最好。向固體培養(yǎng)基中添加3 000 μL/L檸檬醛可完全抑制意大利青霉孢子的萌發(fā)和生長[4]。Tripathi等[5]研究表明，100 μg/L薄荷、500 μg/L灰羅勒和200 μg/L生姜精油可使接種意大利青霉的甜橙貯藏時間分別延長6、6、4 d；延長酸橙的貯藏時間8、6、8 d。40 μL/平板的寬皮柑橘和甜橙精油、0.5 μL/平板檸檬醛和5 μL/平板芳樟醇能完全抑制意大利青霉孢子萌發(fā)和芽管生長[6]。Yahyazadeh等[7]研究指出，熏蒸400 μL/L麝香草和丁香精油可有效殺死湯姆森臍橙和伏令夏橙果實表面接種的意大利青霉。含質(zhì)量分數(shù)0.5%～3%佛手柑精油和殼聚糖的復(fù)合物能不同程度抑制意大利青霉生長[8]。前期研究表明，5.0 μL/mL不同月份（7—10月份）的椪柑果皮精油能完全抑制意大利青霉生長，且椪柑果皮精油中的單一組分，如0.5 μL/mL檸檬醛、辛醛、1.0 μL/mL壬醛、癸醛以及2.0 μL/mLβ-芳樟醇、α-松油醇均能完全抑制意大利青霉菌絲體生長[9]。

α-松油醇又名α-萜品醇，是一種具有丁香味的萜類化合物，廣泛存在于植物精油中[2-9]。研究表明，α-松油醇對多種革蘭氏菌和多種真菌均有較強的抑制作用，是一種潛在的抑菌物質(zhì)[9-11]。本實驗擬探討α-松油醇抑制意大利青霉菌絲體生長的作用機制，為柑橘采后病害生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-松油醇（純度90%） 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；香草醛（分析純） 梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

意大利青霉（P. italicum）分離自腐爛柑橘果實，現(xiàn)保存于湘潭大學(xué)生物與食品工程專業(yè)實驗室。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-250B-D生化培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司；Ecl ipse600光學(xué)顯微鏡 尼康儀器（上海）有限公司；UV2450紫外分光光度計、BL320H電子天平 日本Shimadzu公司；TDL5A 大容量冷凍離心機 長沙英泰儀器有限公司；FA1004N分析天平 上海精密科學(xué)儀器廠；PHS-W系列微機型pH/mV計、DDS-W系列微機型電導(dǎo)率儀 上海般特儀器有限公司；CoolSafe 110-4L真空冷凍干燥機 丹麥Labo Gene公司。

1.3.1 α-松油醇對意大利青霉菌絲體的作用

采用瓊脂稀釋培養(yǎng)法[12]研究α-松油醇對意大利青霉菌絲體生長的影響。α-松油醇的添加量設(shè)定采用倍半稀釋法，實驗終量為0.00、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 μL/mL和8.00 μL/mL。每個培養(yǎng)皿接入3個生長一致的菌餅（d=6.0 mm），置于（25±2）℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 d。以生長2 d時完全沒有菌絲生長的最低添加量作為α-松油醇的最小抑菌濃度（MIC），以生長4 d時殺死99.9%的菌絲生長的最低添加量作為最小殺菌濃度（MFC）[14]，采用十字交叉法每天測量菌絲體生長直徑，用相應(yīng)體積的0.5%吐溫-80為對照（CK），結(jié)果取平均值。挑取CK、MIC、MFC處理4 d后 的菌絲體，光學(xué)顯微鏡下（4（目鏡）×40（物鏡）倍）觀察形態(tài)變化并拍照。

1.3.2 α-松油醇對意大利青霉胞外胞外pH值的影響

采用微型pH/mV計測定α-松油醇對意大利青霉胞外pH值的影響。將意大利青霉孢子洗脫于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（potato dextrose broth，PDB），（25±2）℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)48h后，4 000 r/min離心15 min，水洗3 次，收集菌絲體，重新懸浮于磷酸緩沖液（pH 7.0）中。加入α-松油醇添加量為0、MIC和MFC時處理0、30、60、120 min后，測定胞外pH值，用無菌水作對照。

1.3.3 α-松油醇對意大利青霉胞外電導(dǎo)率的影響

采用微型電導(dǎo)儀測定α-松油醇 對意大利青霉胞外電導(dǎo)率的影響。培養(yǎng)及處理方法如1.3.2節(jié)，測定其胞外電導(dǎo)率，用無菌水作對照。

1.3.4 α-松油醇對意大利青霉菌絲體細胞成分釋放的影響

20世紀80年代，北京與臺北兩地的流行音樂個人演唱會市場都處于起步及初始發(fā)展階段，因此個人演唱會的數(shù)量有限（表2、表4），但仍有香港地區(qū)、韓國、日本以及歐美國家的歌手（表3、表5），前往兩地舉辦個人演唱會。

參照Paul等[13]的方法，培養(yǎng)及處理方法如1.3.2節(jié)，加入α-松油醇添加量為0、MIC、MFC，處理0、30、60、120 min后取樣， 將樣品置于12 000r/min離心2min收集上清液，用紫外分光光度計在波長260 nm處測吸光度，對照組用PBS（pH 7.0）進行校正。

1.3.5 α-松油醇對意大利青霉總脂質(zhì)含量的影響

采用香草醛硫酸比色法[14]測定處理后的菌絲體。在加入α-松油醇添加量為0、MIC、MFC處理120 min后，用真空冷凍干燥機干燥2 h，稱取一定量干燥菌絲體，利用液氮充分研磨，按照體積比1∶1∶1加入甲醇、氯仿、水劇烈振蕩充分萃取脂質(zhì)，將含有脂質(zhì)的混合液與濃硫酸沸水浴加熱10 min，室溫下冷卻后加入磷光體香草醛素充分混勻，在520 nm波長處測其吸光度，最后利用膽固醇標準曲 線計算其脂質(zhì)含量，脂質(zhì)含量以mg/g表示。

1.4 數(shù) 據(jù)分析

每組有3 次重復(fù)，采用常規(guī)的分析方法標注標準偏差，數(shù)據(jù)分析采用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件，ANOVA來分析顯著性差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-松油醇對意大利青霉菌絲體的作用

圖1 1 α-松油醇對意大利青霉菌絲體生長的影響Fig. 1 Effect of α- terpineol on mycelial growth of P. italicum

由圖1可知，隨著添加量增加，α-松油醇對意大利青霉的抑制作用逐漸增強。培養(yǎng)2 d后，當α-松油醇的添加量≥2.00 μL/mL時，意大利青霉基本無生長，說明α-松油醇對意大利青霉的最小抑菌濃度MIC為2.00 μL/mL。培養(yǎng)4 d后，8.00 μL/mL α-松油醇能完全抑制意大利青霉菌絲體生長，0.25～4.00 μL/mL α-松油醇也能不同程度抑制意大利青霉菌絲體生長（P＜0.05），因而α-松油醇對意大利青霉的最小殺菌濃度MFC為8.00 μL/mL。

由圖2可知，α-松油醇對意大利青霉菌絲體形態(tài)存在明顯影響，未處理的菌絲體表面形狀規(guī)則，粗細均勻，結(jié)構(gòu)規(guī)則，處于正常生長狀態(tài)（圖2a）；經(jīng)MIC濃度處理的菌絲體雖較為飽滿，但細胞中 的內(nèi)容物減少（圖2b）；經(jīng)MFC處理后，菌絲體出現(xiàn)了干癟、細小等形態(tài)，細胞內(nèi)容 物泄漏更為嚴重（圖2c）。

圖2 2 α-松油醇對意大利青霉菌絲體形態(tài)的影響Fig.2 Effect of α-terpineol on morphology of P. italicum

2.2 α-松油醇對意大利青霉胞外pH值的影響

圖 33 α-松油醇對意大利青霉胞外pH值的影響Fig.3 Effect of α-terpineol on extracellular pH of P. italicum

由圖3可知，處理30 min時，MIC和MFC處理組的胞外pH值顯著上升，但兩者之間無顯著差異，分別為6.30±0.14和6.37±0.18，顯著高于對照的3.82±0.08（P＜0.05）。隨著處理時間延長到120 min，對照組CK胞外pH值顯著升高，但低于處理組；而MIC與MFC組胞外pH值趨于平緩，無顯著性差異。

2.3 α-松油醇對意大利青霉胞外電導(dǎo)率的影響

圖4 4 α-松油醇對意大利青霉胞外電導(dǎo)率的影響Fig.4 Effect of α-terpineol on extracellular conductivity of P. italicum

由圖 4可知，經(jīng)α-松油醇處理后，意大利青霉的胞外電導(dǎo)率隨處理時間和添加量的增加不斷上升，以0～30 min內(nèi)變化最為明顯。處理30 min時， MIC和MFC處理組的電導(dǎo)率分別為（126.5±8.1）和（146.6±9.7）μS/cm，顯著高于CK組的（63.0±4.4）μS/cm（P＜0.05），之后仍有不同幅度增加。處理120 min時，CK、MIC和MFC處理組電導(dǎo)率比初始電導(dǎo)率分別增加了78.9、132.9、153.2 μS/cm。

2.4 α-松油醇對意大利青霉菌絲體細胞成分釋放的影響

圖5 5 α-松油醇對意大利青霉260 nm細胞成分釋放的影響Fig.5 Effect of α-terpineol on absorbance at 260 nm of P. italicum

由圖5可知，α-松油醇顯著增加意大利青霉260 nm細胞成分釋放，以處理前30 min內(nèi)變化最為明顯。處理30 min時，CK組的OD260nm值為（0.024±0.017），顯著低于MIC處理組（0.129±0.002）以及MFC處理組（0.161±0.013）（P＜0.05）。隨著時間延長，CK組OD260nm值基本保持不變。對MIC和MFC處理組而言，30～60 min內(nèi)OD260nm值仍有顯著增加，但60 min后OD260nm值基本保持不變。

2.5 α-松油醇對意大利青霉總脂質(zhì)含量的影響

圖6 6 α-松油醇對意大利青霉總脂質(zhì)含量的影響Fig. 6 Effect of α-terpineol on total lipids of P. italicum

由圖6可知，處理120 min后，意大利青霉的總脂質(zhì)含量明顯下降，且處理與未處理的意大利青霉總脂質(zhì)含量有顯著性差異（P＜0.05），CK、MIC、MFC的脂質(zhì)含量分別為（238.8±45.6）、（138.0±16.8）和（112.4±14.5）mg/g，但MIC和MFC處理組之間差異不顯著。

3 討 論

本實驗探討了α-松油醇對意大利青霉菌絲體生長的影響，結(jié)果表明，α-松油醇也能不同程度抑制意大利青霉菌絲體生長，最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MFC）分別為2.00 μL/mL和8.00 μL/mL，這一結(jié)果與前期研究結(jié)果一致，但優(yōu)于不同發(fā)育時期的椪柑精油[9]。

關(guān)于萜類化合物的抑菌機制，目前了解的不是很透徹。通常認為，萜類化合物能破壞并穿透細菌及真菌細胞的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，增加膜流動性，破壞細胞膜的完整性，提高膜通透性，細胞內(nèi)容物發(fā)生泄漏，最終抑制細菌及真菌生長[15-22]。本實驗中也存在類似現(xiàn)象，當添加量為MIC和MFC的α-松油醇加入后，意大利青霉菌絲體胞外pH值、胞外電導(dǎo)率以及OD260nm都有顯著上升，且在0～30 min時變化最快。胞外pH值的增加意味著胞內(nèi)pH值的下降，細胞因H+積累而發(fā)生酸化，易造成細胞內(nèi)生理生化過程發(fā)生不可逆的損傷[18]。電導(dǎo)率的增加與胞內(nèi)K+、Mg2+、Ca2+等外泄有關(guān)[18-20]，30 min時MIC、MFC組的電導(dǎo)率分別達到了（150.3±8.1）和（161.7±10.3）μS/cm，顯著高于CK組（P＜0.05），直至處理120 min，各處理組電導(dǎo)率仍存在顯著性差異，說明細胞膜通透性發(fā)生了變化。260 nm是 核酸的特征波長，在處理過程中，0～120 min間各組OD260nm值差異顯著，且在30 min時處理組就已經(jīng)明顯高于CK組，表明意大利青霉胞內(nèi)核酸等物質(zhì)泄漏量增多，暗示著細胞內(nèi)的遺傳過程受到影響[13,21-22]。脂質(zhì)占細胞干質(zhì)量的6 0%～80%，是細胞膜的結(jié)構(gòu)物質(zhì)[14]，在120 min時MIC、MFC處理組脂質(zhì)含量分別下降100.8、126.4 mg/g（P＜0.05），說明細胞膜的組成發(fā)生變化，對細胞膜的通透性及細胞活性產(chǎn)生了潛在的傷害。

4 結(jié) 論

α-松油醇是一種極具潛力的抑菌物質(zhì)，可有效破壞意大利青霉菌絲體細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，增加細胞膜通透性，致使胞內(nèi)物質(zhì)如金屬離子、核酸等外泄以及胞內(nèi)H+積累，從而導(dǎo)致意大利青霉的菌絲體死亡。

[1] 龍超安, 鄧伯勛, 何秀娟. 柑橘青、綠霉病高效拮抗菌34-9的篩選及其特性研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2005, 38(12): 2434-2439.

[2] SHARMAN N, TRIPATHI A. Fungitoxicity of the essential oil of Citrus sinensis on post-harvest pathogens[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2006, 22(6): 587-593.

[3] CACCIONI D R L, GUIZZARDI M, BIONDI D M, et al. Relationship between volatile components of citrus fruit essential oils and antimicrobial action on Penicillium digitatum and Penicillium italicum[J]. International Journal of Food Microbiology, 1998, 43(1/2): 73-79.

[4] KLIEBER A, SCOTT E, WURYATMO E. Effect of method of application on antifungal eff cacy of citral against postharvest spoilage fungi of citrus in culture[J]. Australasian Plant Pathology, 2002, 31(4): 329-332.

[5] TRIPATHI P, DUBEY N K, BANERJI R, et al. Evaluation of some essential oils as botanical fungitoxicants in management of postharvest rotting of citrus fruits[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2004, 20(3): 317-321.

[6] DROBY S, EICK A, MACARISIN D, et al. Role of citrus volatiles in host recognition, germination and growth of Penicillium digitatum and Penicillium italicum[J]. Postharvest Biology and Technology, 2008, 49(3): 386-396.

[7] YAHYAZADEH R, OMIDBAIGI Z R, FAGHIH-NASIRI M, et al. Control of Penicilliu m decay on citrus fruit using essential oil vapours of thyme or clove inside polyethylene and nano-clay polyethylene films[J]. The Journal of Horticultural Science and Biotechnology, 2009, 84(4): 403-409.

[8] SáNCHEZ-GONZáLEZ l, CHáFER M, CHIRALT A, et al. Physical properties of edible chitosan f lms containing bergamot essential oil and their inhibitory action on Penicillium italicum[J]. Carbohydrate Polymers, 2010, 82(2): 277-283

[9] 賈雷, 何湘麗, 陶能國, 等. 不同發(fā)育期檻柑精油對意大利青霉和指狀青霉的抑制作用[J]. 食品工業(yè)科技, 2013, 34(7): 68-72.

[10] PARK M J, GWAK K S, YANG I, et al. Effect of citral, eugenol, nerolidol and α-terpineol on the ultrastructural changes of Trichophyton mentagrophytes[J]. Fitoterapia, 2009, 80(5): 290-296.

[11] SCORA K M, SCORA R W. Effect of volatiles on mycelium growth of Penicillium digitatum, P. italicum, and P. ulaiense[J]. Journal of Basic Microbiology, 1998, 38 (5/6): 405-413.

[12] SHARMA N, TRIPATHI A. Effects of Citrus sinensis (L.) Osbeck epicarp essential oil on growth and morphogenesis of Aspergillus niger (L.) Van Tieghem[J]. Microbiological Research, 2008, 163(3): 337-344.

[13] PAUL S, DUBEY R C, MAESWARI D K, et al. Trachyspermum ammi (L.) fruit essential oil influencing on membrane permeability and surface characteristics in inhibiting food-borne pathogens[J]. Food Control, 2011, 22(5):725-731.

[14] HETAL G A, SARAN M M, ABU S A N K, et al. Effects of Cymbopogon citratus L.essential oil on the growth ,morphogenesis and af atoxin production of Aspergillus f avus ML2-strain[J]. Journal of Basic Microbiology, 2007, 47(1): 5-15.

[15] HADA T, INOUE Y, SHIRAISI A, et al. Leakage of K+ions from Staphylococcus aureus in response to tea tree oil[J]. Journal of Microbiological Methods, 2003, 53 (3): 309-312.

[16] SHAO X F, CHENG S, WANG H F, et al. The possible mechanism of antifungal action of tea tre oil on Botrytis cinerea[J]. Journal of Applied Microbiology, 2013, 114(6): 1642-1649.

[17] BENNIS S, CHAMI F, Chami N, et al. Surface alteration of Saccharomyces cerevisiae induced by thymol and eugenol[J]. Letters in Applied Microbiology, 2004, 38(6): 454-458.

[18] RAYBAUDI-MASSILIA R M, MOSQUEDA-MELGAR J, MARTINBELLOSO O. Antimicrobial activity of essential oils on Salmonella enteritidis, Escherichia coli, and Listeria innocua in fruit juices[J]. Journal of Food Protection, 2006, 69(7): 1579-1586.

[19] BARD M, ALBRECHT M R, GUPTA N, et al. Geraniol interferes with membrane functions in strains of Candida and Saccharomyces[J]. Lipids, 1988, 23(6): 534-538.

[20] BURT S. Essential oils: their antibacterial properties and potential applicati ons in foods: a review[J]. International Journal of Food Microbiology, 2004, 94(3): 223-253.

[21] DEVI K P, NISHA S A, SAKTHIVEL R, et al. Eugenol (an essential oil of clove) acts as an antibacterial agent against Salmonella typhi by disrupting the cellular membrane[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2010, 130(1): 107-115.

[22] de SOUZA E L, de BARROS J C, de OLIVEIRA C E V, et al. Influence of Origanum vulgare L. essential oil on enterotoxin production, membrane permeability and surface characteris tics of Staphylococcus aureus[J]. International Journal of Food Microbiology, 2010, 137(2): 308-311.

Inhibitory Effect of α-Terpineol on Penicillium italicum

OUYANG Qiu-li, JIA Lei, TAO Neng-guo*, HE Xiang-li
(College of Chemical Engineering, Xiangtan University, Xiangtan 411105, China)

The effect of α-terpineol at various concentrations on the morphology and mycelial growth of Penicillium italicum was evaluate d, and the corresponding mechanism was explored. Res ults showed that α-terpineol had a significant inhibitory effect on the mycelial growth of P. italicum, with minimal inhibitory concentr ation (MIC) and minimal fungicidal concentration (MFC) of 2.00 and 8.00 ?L/mL, respectively. After being treated with α-t erpineol a t MIC or MFC, marked increases in the extracellular pH, extracellular conductivity and absorbance at 260 nm were observed. Moreover, a decrease in total lip id content was also observed. Our research indicated that α-terpineol can increase the membrane permeability and destroy the integr ity of the membrane of P. italicum, thus resulting in the leakage of cellular materials and inhibiting the mycelial growth of P. italicum.

α-terpineol; Penicillium italicum; cell membrane; inhibitory effect

S436.66

A

1002-6630（2014）11-0032-04

10.7506/spkx1002-6630-201411007

2013-07-13

國家自然科學(xué)基金面上項目（31271964）；湖南省教育廳青年項目（12B126）；國家級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目（201210530012）

歐陽秋麗（1990—），女，碩士研究生，研究方向為柑橘貯藏與保鮮。E-mail：ouyang199006@126.com

*通信作者：陶能國（1979—），男，教授，博士，研究方向為柑橘貯藏與保鮮。E-mail：nengguotao@126.com