金櫻子對(duì)阿霉素心肌損傷大鼠的抗氧化和抗凋亡保護(hù)作用

羅衛(wèi)民 劉越峰 羅湘玉 張 軍▲

1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院心胸外科，湖北十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市人民醫(yī)院眼科，湖北十堰 442000

阿霉素 （Doxorubicin，DOX） 是一種廣泛應(yīng)用于腫瘤治療的蒽環(huán)類抗生素。盡管其對(duì)包括白血病在內(nèi)的多種惡性腫瘤具有抑制作用，但其蓄積性不可逆性心肌病以及充血性心衰限制了其使用[1]。 DOX 導(dǎo)致的毒性心肌病原因很多， 其中活性氧 （reactive oxygen species，ROS） 介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡是其重要機(jī)制之一[2]。 因此，在DOX 治療的同時(shí)預(yù)防性使用抗氧化藥物干預(yù)，有望降低其副作用[3]。 近年來，某些藥用植物在心血管疾病的預(yù)防過程中具有一定的預(yù)防作用[4]，金櫻子為薔薇科金櫻子（Rosa Laevigata Michx.，RLM）的果實(shí)，研究發(fā)現(xiàn)它具有強(qiáng)大的抗氧化和清除自由基能力[5-6]。本研究旨在觀察RLM 對(duì)DOX 誘發(fā)的心臟毒性的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑

DOX 購自意大利Pharmacia 公司（批號(hào)：8NB002-A）， 血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶 （aspartate transaminase，AST）檢測(cè)試劑盒購自Quimica Clinica Aplicada。 血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和肌酸激酶（creatine kinase，CKMB）試劑盒為Stanbio 產(chǎn)品。還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）及丙二醛（myocardial lipid peroxide，MDA）檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物技術(shù)研究所。心肌腫瘤壞死因子α（tumour necrosis factor-alpha，TNF-α）ELISA 試劑盒和caspase-3 的比色測(cè)定試劑盒購自Quantikine。 分析純?cè)噭┲饕徸許igma-Aldrich 公司。

金櫻子購于十堰市中草藥材公司，經(jīng)去籽后用煎藥機(jī)進(jìn)行熬煎。金櫻子的鑒定由湖北醫(yī)藥學(xué)院肖勝全教授完成，其提取液濃度為2.0 g/mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

成年雄性Wistar 大鼠由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供，體重（250±5）g，在SPF 環(huán)境下給予標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室的水和食物飼養(yǎng)2 周。 大鼠隨機(jī)分成5 組：空白對(duì)照組（8 只），大鼠接受等體積的生理鹽水作為陰性對(duì)照；DOX 模型組（15 只）， 大鼠連續(xù)兩周每間隔48 h注射DOX（2.5 mg/kg，ip）共6 次，使其累積劑量達(dá)15 mg/kg。RLM 高、中、低劑量組（每組各30 只）：在DOX模型組的基礎(chǔ)上，大鼠每日給予RLM（1、2、5 g/kg）灌胃，DOX 停止后，持續(xù)RLM 灌胃4 周。

1.3 血清及心肌組織的獲取

大鼠處理結(jié)束后， 獲取血液標(biāo)本，8000×g 離心10 min 獲取血清用于測(cè)定TC、AST、LDH 和CK-MB。隨后解剖大鼠，分離心臟，生理鹽水漂洗2 次。 將心臟組織剪切，制備成20%的勻漿后，二喹啉甲酸法測(cè)定其總蛋白濃度及AST、LDH、CK-MB 活性、TC 水平（mg/dL）。

1.4 心肌MDA 測(cè)定

心臟勻漿與等體積2.3%的KCl 混合，600×g，4℃離心15 min，獲取上清用于測(cè)定MDA。其原理基于脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物與硫代巴比妥酸發(fā)生過氧化反應(yīng)，生成粉紅色的有色絡(luò)合物，從而用分光光度計(jì)以四甲氧基丙烷為標(biāo)準(zhǔn)品，532 nm 和520 nm 波長處測(cè)量其OD值。 結(jié)果用nmol/mg 表示。

1.5 心肌GSH 測(cè)定

將等體積的心臟勻漿和預(yù)冷7.5%5-磺酸基水楊酸緩沖液以沉淀蛋白。隨后4℃，600×g 離心10 min，獲取上清用于測(cè)量還原型GSH。 其原理基于還原型GSH能與5，5-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）反應(yīng)，產(chǎn)物在421 nm波長處能形成最大吸收峰。 含量用mg/g 組織表示。

1.6 TNF-α 和caspase-3 測(cè)定

50 mg 心肌組織加入0.8 mL pH 7.4 的裂解緩沖液中制成勻漿，10 000×g，4℃離心15 min。 獲取上清用于TNF-α 和caspase-3 測(cè)定。 其中TNF-α 根據(jù)試劑盒提供的步驟進(jìn)行，采用固相夾心ELISA 法，四甲基聯(lián)苯胺（TMB）法顯色并于450 nm 波長處測(cè)量其吸光度，用pg/mg 蛋白表示。 采用間接法測(cè)定caspase-3活性，基于caspase-3 切除底物分子DEVD-pNA 中的發(fā)光基團(tuán)pNA，隨后在405 nm 處用測(cè)量其吸光度，用OD 值表示，從而間接反應(yīng)其活性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， 計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，并采用單因素方差分析數(shù)據(jù)，行t 檢驗(yàn)，以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血生化指標(biāo)情況

心臟功能和血脂參數(shù)顯示，DOX 注射后， 血清AST、LDH、CK-MB、TC 水平顯著增高。 而同時(shí)給予RLM 干預(yù)后，這些參數(shù)隨著RLM 濃度的增高而不斷改善，見表1。

表1 不同濃度金櫻子處理對(duì)阿霉素心肌損傷大鼠血生化指標(biāo)的影響（±s）

表1 不同濃度金櫻子處理對(duì)阿霉素心肌損傷大鼠血生化指標(biāo)的影響（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與DOX 模型組比較，#P <0.05；AST：血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶；LDH：乳酸脫氫酶；TC：血清總膽固醇；CK-MB：肌酸激酶；RLM：金櫻子；DOX：阿霉素

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2.2 不同濃度RLM 對(duì)心肌DOX 處理后MDA 含量的影響

與空白對(duì)照組相比，DOX 處理組能誘導(dǎo)心肌MDA明顯增加（P<0.01），給予不同濃度RLM 處理后，心肌MDA 含量隨之降低，其中DOX+5 g/kg RLM 處理后，MDA 含量降低最多[（0.82±0.14） nmol/mg]。 見圖1。

圖1 RLM 對(duì)血清丙二醛含量的影響

2.3 不同濃度RLM 對(duì)DOX 心肌毒性大鼠GSH 含量的影響

與空白對(duì)照組相比，DOX 組大鼠血清總GSH 含量顯著降低（P < 0.01）。而同時(shí)給予不同濃度RLM 處理后，GSH 含量隨之升高。 5 g/kg RLM 處理大鼠后，GSH 含量[（1.06±0.11） pg/g]接近對(duì)照組水平（圖2）。

圖2 RLM 對(duì)血清還原型谷胱甘肽含量的影響

2.4 RLM 干預(yù)對(duì)大鼠血清TNF-α 含量的影響

空白對(duì)照組大鼠血清中TNF-α 含量較低，DOX處理后TNF-α 顯著增高（P ＜0.01）。 RLM 干預(yù)能以劑量依賴性方式降低血清中TNF-α 的含量， 其中DOX+5 g/kg RLM 處 理 后，TNF-α 含 量 降 低 最 多[（3.49±0.05） pg/mg]，見圖3。

圖3 RLM 對(duì)血清TNF-α 含量的影響

2.5 RLM 抑制caspase-3 活性

DOX 處理后，caspase-3 活性增加了近50%。 同時(shí)經(jīng)1～5 g/kg RLM 處理后，caspase-3 活性逐漸降至正常水平， 其中DOX+5 g/kg RLM 處理后，caspase-3活性降低最多（0.83±0.02）。 見圖4。

圖4 RLM 對(duì)caspase-3 活性的影響

3 討論

DOX 是一種抗腫瘤抗生素，可抑制RNA 和DNA的合成，對(duì)RNA 的抑制作用最強(qiáng)，抗瘤譜較廣，對(duì)多種腫瘤均有作用，屬周期非特異性藥物，對(duì)各種生長周期的腫瘤細(xì)胞都有殺滅作用。主要適用于急性白血病， 對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病及粒細(xì)胞白血病均有效，一般作為第二線藥物，即在首選藥物耐藥時(shí)可考慮應(yīng)用此藥。 惡性淋巴瘤， 可作為交替使用的首選藥物。DOX 和其他奎寧蒽環(huán)類藥物一樣， 主要的毒性反應(yīng)有： 白細(xì)胞和血小板減少，60%～80%的患者可發(fā)生；100%的患者有不同程度的毛發(fā)脫落， 停藥后可以恢復(fù)生長；心臟毒性，表現(xiàn)為心律失常，ST-T 改變，多出現(xiàn)在停藥后的1～6 個(gè)月[7]。本研究通過DOX 建立心肌毒性模型發(fā)現(xiàn)，血清AST、LDH 和CK-MB 顯著增加，這可能是由于DOX 損傷心肌細(xì)胞膜后，AST、LDH 和CK-MB 漏出所致。 本研究還發(fā)現(xiàn)，DOX 還可以導(dǎo)致TC 含量增高，這可能是由于DOX 導(dǎo)致腎病綜合征所致[8]。 RLM 屬薔薇科薔薇屬常綠蔓性灌木野生果樹，其果實(shí)中總糖含量達(dá)24%，其中多糖含量約為金櫻子果實(shí)的8.73%。 研究顯示，RLM 的抗氧化能力與丁基羥基甲苯相當(dāng)， 并能顯著清除超氧陰離子自由基、抑制羥自由基對(duì)細(xì)胞膜的破壞而引起的溶血和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的形成，從而具有顯著的抗氧化作用[9]。 此外，RLM 金櫻子能減輕糖尿病腎病大鼠的氧化損傷，減少過氧化質(zhì)，升高抗氧化酶活性，機(jī)制可能與干預(yù)氧化應(yīng)激、抑制核因子-κB、TNF-α 表達(dá)有關(guān)。 本研究顯示通過RLM 灌胃后， 大鼠的血清指標(biāo)得到了顯著的改善[10-13]。 同時(shí)，本研究還觀察了RLM 對(duì)氧化應(yīng)激的影響。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DOX 能顯著增加心肌中MDA 含量，同時(shí)顯著降低GSH 水平。 這可能是DOX 導(dǎo)致氧化應(yīng)激，大量氧自由基的產(chǎn)生導(dǎo)致GSH 減少。 脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷后引起AST、LDH 和CK-MB漏出至循環(huán)系統(tǒng)是由于心臟損傷[14]。 口服RLM 能明顯降低脂蛋白過氧化物酶而提高GSH，這表明這些藥物能清除自由基和減少細(xì)胞損傷。 另一方面，氧化應(yīng)激可激活p38 絲裂原激活的蛋白激酶和核因子-κB，從導(dǎo)致TNF-α 大量合成， 反過來加重氧化應(yīng)激狀態(tài)而使線粒體膜通透性發(fā)生改變，隨后導(dǎo)致自由基和細(xì)胞色素C 從線粒體中釋放到細(xì)胞質(zhì)， 激活caspase-3而引起凋亡發(fā)生[15-17]。 RLM 可能通過抑制組織中的應(yīng)激反應(yīng)而降低心肌中TNF-α 和caspase-3 含量。

總之，本研究證實(shí)RLM 對(duì)DOX 導(dǎo)致的心肌損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抗氧化、抗炎和抗凋亡有關(guān)。 在下一步研究中，筆者將對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步探討。

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