樺褐孔菌多糖脫色方法及其成分分析

玄光善，李 青，王艷波

（青島科技大學，山東 青島 266042）

樺褐孔菌多糖脫色方法及其成分分析

玄光善，李 青，王艷波

（青島科技大學，山東 青島 266042）

對樺褐孔菌多糖的脫色方法和單糖的組成進行研究。首先考察活性炭粉、過氧化氫、殼聚糖、聚酰胺層析柱的脫色效果。經(jīng)脫蛋白、脫色后的多糖進行1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化，采用高效液相色譜法分析單糖組成。4種脫色方法對樺褐孔菌多糖均有效果，活性炭和聚酰胺層析柱脫色效果明顯優(yōu)于過氧化氫和殼聚糖脫色法，聚酰胺層析柱脫色是較好的方法，其脫色率為89.3%、多糖保留率為91.7%。結(jié)果表明：樺褐孔菌多糖粗品主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖組成，其物質(zhì)的量比為2.13：1.36：7.01：2.98：1：1.78。

樺褐孔菌；多糖；脫色；柱前衍生化；成分分析

樺褐孔菌（Inonotus obliquus）屬樺褐孔菌屬于擔子菌亞門、層菌綱、非褐菌目、多孔菌科，是一種傳統(tǒng)的藥用真菌[1]。主產(chǎn)于俄羅斯、北歐、波蘭、日本北海道以及中國黑龍江大小興安嶺和吉林長白山地區(qū)[2]。其具有抗腫瘤[3]、降血糖[4]、調(diào)節(jié)免疫功能[5]、抗氧化[6]、抗血脂[7]、抗哮喘[8]等作用。

樺褐孔菌中含有多糖、三萜類、樺褐孔菌醇、栓菌酸、樺褐孔菌素、木質(zhì)素、黑色素等200多種化合物[9]。樺褐孔菌多糖提取液中混有的色素對其外觀品質(zhì)有一定的影響，并且影響多糖的分離純化、定性定量分析與結(jié)構(gòu)鑒定，因此在提取、分析前需要去除色素[10]。傳統(tǒng)的脫色方法有活性炭法，過氧化氫氧化法等，但這些方法均存在缺陷：活性炭脫色時間長、多糖損失量大，且多糖提取液中混雜的活性炭難以去除；過氧化氫脫色有可能破壞多糖的生物活性。因此，亟需尋找一種有效的脫色方法。郭巧玲等[11]研究了殼聚糖對菠蘿粗多糖脫色的影響，脫色率能達到74.3%。陳義勇等[12]采用聚酰胺層析柱對茶多糖進行脫色純化研究，脫色率能達到82.3%。但樺褐孔菌多糖脫色的研究則較少。本研究選用活性炭、過氧化氫、殼聚糖和聚酰胺層析柱4種脫色方法，對樺褐孔菌多糖進行脫色，并測定多糖保留率和脫色率，評價脫色效果并篩選樺褐孔菌多糖的最佳脫色方法。

常用的單糖組成分析方法有氣相色譜法和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[13]。范柳萍等[14]采用糖腈乙酸酯衍生物氣相色譜法定量樺褐孔菌多糖糖基組成。張麗霞[15]采用糖醇甲基醚衍生物氣相色譜法分析了樺褐孔菌多糖中單糖組成。馬定遠等[16]建立了單糖組成分析的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）柱前衍生化-HPLC新方法，該法簡便、快速、準確、重復(fù)性好。本實驗亦采用PMP柱前衍生化HPLC法對樺褐孔菌多糖的單糖組成進行分析，為其結(jié)構(gòu)和功能的進一步研究及開發(fā)提供了基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樺褐孔菌采自大興安嶺；粉末活性炭（分析純） 天津市標準科技有限公司；30%過氧化氫（分析純） 天津市博迪化工有限公司；殼聚糖（脫乙酰度80.0%～95.0%）、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；聚酰胺（80～100目） 上海一基生物試劑有限公司；PMP實驗室自制[17]；乙腈（色譜純） 天津市永大化學試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV762型紫外-可見分光光度計 北京萊伯泰科儀器有限公司；U3000高效液相色譜儀 戴安（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樺褐孔菌多糖的提取

樺褐孔菌粉碎過40 目篩，稱取100 g菌粉，用40倍水于90 ℃條件下提取2.5 h，抽濾得濾液，減壓濃縮，加4倍體積的95%乙醇，4 ℃靜置過夜，離心收集沉淀，沉淀用無水乙醇洗滌3 次，真空干燥得多糖粗品。取樺褐孔菌粗多糖10 g，加1 L蒸餾水溶解，用三氯乙酸-正丁醇法去除游離蛋白：將等體積的三氯乙酸-正丁醇溶液（1：10，V/V）加入多糖溶液中，磁力攪拌30 min，在分液漏斗中靜置3 h，取下清液，于4 ℃冰箱中保存，備用。

1.3.2 多糖保留率的測定

1.3.2.1 標準曲線的建立

本實驗采用苯酚-硫酸法測定多糖含量。

精確稱取105 ℃干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖標準品50.0 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL葡萄糖標準液。吸取1.0 mg/mL的葡萄糖標準液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分別置于10 mL容量瓶中，定容。再分別量取2.0 m L置干燥具塞試管中，加6%苯酚1.0 mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0 mL，置沸水浴加熱30 min后取出，冷水冷卻至室溫；另取蒸餾水2.0 mL，同上操作，做空白對照，于486 nm波長處測定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標，作標準曲線，得標準曲線回歸方程。

1.3.2.2 換算因子的測定

準確稱取已干燥至恒質(zhì)量的樺褐孔菌多糖10 mg，定容于100 mL容量瓶中，備用。精密量取該溶液2.0 mL，按照上述苯酚-硫酸法測定吸光度，重復(fù)3 次，計算出樺褐孔菌多糖中葡萄糖的質(zhì)量濃度，按式（1）計算換算因子[18]：

式（1）中：A為所配液體中多糖質(zhì)量濃度/（mg/mL）；B為標準曲線計算所得葡萄糖質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.2.3 苯酚-硫酸法測定多糖含量

按上述苯酚-硫酸法，分別測定樺褐孔菌多糖原液及不同脫色方法脫色后溶液的吸光度。通過標準曲線和式（2）計算樣品中多糖含量、式（3）計算多糖保留率[19]：

式（2）中：C為糖的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為體積/mL；D為稀釋倍數(shù)；W為樣品糖的質(zhì)量/mg。

式（3）中：C1為脫色前得多糖含量/%；C2為脫色后的多糖含量/%。

1.3.3 多糖脫色

采用活性炭粉、過氧化氫、殼聚糖和聚酰胺對樺褐孔菌多糖進行脫色。利用分光光度計在359 nm波長處測定多糖溶液脫色前后的吸光度[20]，并按式（4）計算脫色率，比較各種方法的脫色效果。

式（4）中：A1為脫色前的吸光度；A2為脫色后的吸光度。

1.3.3.1 活性炭粉末脫色

分別取脫蛋白溶液20 mL，加入 0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 g活性炭粉，搖勻后于40℃水浴靜置5 h，抽濾，濾液定容至100 mL容量瓶中，測脫色率和多糖保留率。

1.3.3.2 過氧化氫脫色

分別取脫蛋白溶液20 mL，加入30%過氧化氫4、8、12、16、20 mL，55℃恒溫水浴攪拌3 h，調(diào)節(jié)pH值至8.8～9之間，最終定容至100 mL，測脫色率和多糖保留率。

1.3.3.3 殼聚糖脫色

1%殼聚糖的配制：精確稱取殼聚糖1 g，溶于50 mL水中，再加入1 mL冰乙酸，放入80～90℃的恒溫水浴鍋中，攪拌至溶解，再用蒸餾水定容至100 mL，于85 ℃保溫45 min即可使用[21]。

取脫蛋白溶液20 mL 6 份，加入適量1%殼聚糖溶液，使其體積分數(shù)分別為5%、6%、7%、8%、9%、10%，用0.2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至5，于45℃恒溫水浴鍋中攪拌20 min，靜置保溫40 min，離心，測脫色率和多糖保留率。

1.3.3.4 聚酰胺層析柱脫色

聚酰胺預(yù)處理：取適量聚酰胺用90%～95%乙醇浸泡，不斷攪拌，去除氣泡后裝入柱中。用3～4 倍柱體積的90%～95%乙醇洗脫，至洗脫液透明并在蒸干后無殘渣。再依次用2～2.5 倍柱體積的5% NaOH溶液、1 倍柱體積的蒸餾水、2～2.5倍柱體積的10%醋酸溶液洗脫，最后用蒸餾水洗脫至中性，備用[22]。

稱取2、4、6、8、10 g聚酰胺，倒入一定量的蒸餾水中加熱15 min，使之分散均勻，裝層析柱，用蒸餾水洗脫完全。分別量取20 mL脫蛋白溶液，裝入聚酰胺層析柱中進行吸附，用1倍柱體積的蒸餾水以1.0 mL/min的流速進行洗脫，測脫色率和多糖保留率。

1.3.4 單糖組成分析

1.3.4.1 單糖標樣的衍生化

由文獻[20]知，樺褐孔菌粗多糖主要由葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖和木糖組成。精密稱取對照品甘露糖0.018 4 g、鼠李糖0.013 7 g、葡萄糖0.019 7 g、半乳糖0.017 3 g、木糖0.014 2 g、阿拉伯糖0.0109 g，用蒸餾水溶解定容于10 mL容量瓶中，搖勻。取單糖對照品混合溶液400 μL與250 μL 0.3 mol/L NaOH溶液混勻，再加250 μL 0.5 mol/L的PMP-甲醇溶液，渦旋混勻；70℃烘箱中反應(yīng)100 min，冷卻，加500 μL 0.3 mol/L HCl溶液中和，渦旋2 min后，再加等體積的氯仿，振搖，靜 置，棄去氯仿層，重復(fù)萃取3 次。水相用0.45 μm微孔膜過濾后供HPLC進樣分析。

1.3.4.2 多糖的水解及衍生化

吸取1 mL質(zhì)量濃度為4～5 g/L的多糖樣品溶液于安瓿瓶中，加入1 mL 4 mol/L三氟乙酸溶液，充N2封管，110℃烘箱中水解3 h；冷卻后打開蓋，取600 μL水解液加600 μL甲醇后用N2吹干，如此重復(fù)加甲醇并用N2吹3次，去除三氟乙酸；加入蒸餾水400 μL充分溶解殘渣，加入250 μL 0.3 mol/L NaOH溶液，混勻，再加250 μL 0.5 mol/L PMP-甲醇溶液，漩渦混勻，在70℃的烘箱中反應(yīng)100 min，冷卻后按上述方法中和、萃取，并用微孔膜過濾。

1.3.4.3 色譜條件

色譜柱：GlobalsilTMC18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速1.0 mL/min；流動相：溶劑A為50 mmol/L磷酸緩沖液（KH2PO4-NaOH，pH 6.9），溶劑B為乙腈；梯度洗脫：0～12min，15% B；12～20min，15%～20% B；20～35min，20% B；35～45min，20%～15% B；45～50min，15% B。檢測波長250 nm；進樣體積20 μL。

1.3.4.4 標準曲線繪制及單糖組成分析

分別稱取葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖和木糖對照品配制成一系列不同質(zhì)量濃度的標準溶液，按上述方法進行衍生化，并在上述色譜條件下進樣分析，記錄峰面積，以峰面積為縱坐標、質(zhì)量濃度為橫坐標，作標準曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖保留率

2.1.1 葡萄糖含量測定標準曲線

按上述方法配制一系列質(zhì)量濃度的葡萄糖標準液，用苯酚-硫酸法顯色，在486 nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線，計算得到標準曲線回歸方程：y=0.058 71x＋0.001 37，R2=0.999 0，線性關(guān)系良好，線性范圍為0.01～0.12 mg/mL。

2.1.2 換算因子

準確稱取已干燥至恒質(zhì)量的樺褐孔菌多糖10 mg，定容于100 mL容量瓶中。精密量取0.1 mg/mL樺褐孔菌多糖溶液2.0 mL，按照上述苯酚-硫酸法測定吸光度，重復(fù)3次測得的換算因子F=1.17。

2.2 不同脫色劑的脫色效果

圖1 不同脫色劑對樺褐孔菌多糖的脫色效果Fig.1 Effects of different decolorants on decolorization of Inonotus obliquus polysaccharides

由圖1A可知，隨著活性炭用量的增加，多糖脫色率增加，而多糖保留率逐漸降低。而當活性炭含量大于0.06 g/mL時，多糖脫色率無明顯增加，脫色率達到85.7%。因此，利用活性炭對樺褐孔菌多糖進行脫色的條件為活性炭用量0.06 g/mL、脫色溫度40 ℃、脫色時間5 h。

由圖1B可知，過氧化氫對樺褐孔菌多糖的脫色效果明顯，但多糖保留率較低。當過氧化氫含量大于0.4 mL/mL時，脫色效果無明顯提高，脫色率達到82.8%，而多糖保留率明顯降低。因此過氧化氫對樺褐孔菌多糖進行脫色條件選為加入過氧化氫含量0.4 mL/mL、脫色溫度50 ℃、脫色時間3 h、pH 8.8～9。

由圖1C可知，殼聚糖對樺褐孔菌多糖的脫色效果不明顯，多糖脫色率隨殼聚糖用量增大而增大，當1%殼聚糖添加量大于7%時，脫色率達到48.3%，脫色率增大幅度變小，而多糖保留率明顯下降。因此，殼聚糖對樺褐孔菌多糖進行脫色條件選為1%殼聚糖加入量7%、脫色溫度45 ℃、脫色時間1 h、pH 5。

從圖1D可知，隨著聚酰胺用量的增加，脫色率逐漸增大，多糖的保留率逐漸下降。當聚酰胺用量超過8 g/20 mL脫蛋白溶液時，多糖脫色率變化幅度不大，脫色率達到89.3%，但多糖的保留率明顯下降。為了盡可能多地保留多糖、節(jié)省實驗成本，確定聚酰胺對樺褐孔菌多糖進行脫色條件選為聚酰胺用量為8 g/20 mL脫蛋白溶液，采用1.5 倍柱體積的去離子水以1.0 mL/min的流速進行洗脫。

從脫色率及多糖保留率兩方面進行考察，4種方法對樺褐孔菌多糖均有脫色效果。殼聚糖是較新的脫色方法，雖然多糖保留率較高，但是多糖顏色還是很深、脫色率低。過氧化氫脫色效果良，但易對多糖造成破壞，并且色素物質(zhì)只是被氧化為無色，仍存在于多糖中，并不是真正意義上的去除。聚酰胺層析柱和活性炭的脫色效果優(yōu)，但活性炭法的多糖損失嚴重，并且殘留在多糖溶液中的活性炭難以完全去除，所以聚酰胺層析柱脫色是較好的方法。

2.3 單糖組成分析

2.3.1 單糖標樣的衍生化分析

分別稱取葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖和木糖對照品配制成一系列不同質(zhì)量濃度的標準溶液，按上述方法進行衍生化，并在上述色譜條件下進樣分析，記錄峰面積，以峰面積為縱坐標、質(zhì)量濃度為橫坐標，作標準曲線，結(jié)果見表1。根據(jù)測得各種糖的峰面積得到對應(yīng)的質(zhì)量濃度，各單糖的質(zhì)量濃度比即為物質(zhì)的量比。

表1 單糖的標準曲線Table1 Calibration curves for different monosaccbrides

6種單糖對照品按上述方法衍生化，并在上述色譜條件下進樣檢測，結(jié)果見圖2，這些單糖組分得到了良好地分離。

圖2 標準單糖PMP衍生物的HPLLCC圖Fig.2 HPLC chromatogram of the PMP derivatives of monosaccharide standards

2.3.2 樺褐孔菌多糖的PMP衍生化分析

樺褐孔菌多糖按上述方法衍生化后，進行HPLC分析，結(jié)果見圖3。

圖3 樺褐孔菌多糖水解樣品PMP衍生物的HPLLCC圖Fig.3 HPLC chromatogram of the PMP derivatives of hydrolyzed Inonotus obliguus polysaccharides

根據(jù)混合單糖標樣PMP衍生物的色譜圖（圖2）中色譜峰保留時間，來判斷多糖水解產(chǎn)物中單糖的種類。由圖3可知，樺褐孔菌多糖水解產(chǎn)物衍生物色譜圖出現(xiàn)8 個峰。在樺褐孔菌多糖的PMP衍生化色譜圖中在40.1 min處出現(xiàn)了未知的峰，經(jīng)HPLC-MS分析未知物的m/z為164，具體結(jié)構(gòu)有待進一步確認。

由峰面積及各單糖標準曲線回歸方程計算得各單糖質(zhì)量濃度，各單糖物質(zhì)的量比（甘露糖：鼠李糖：葡萄糖：半乳糖：木糖：阿拉伯糖）為2.13：1.36：7.01：2.98：1：1.78。

3 結(jié) 論

癌癥是危害人類健康的最主要的疾病之一，而樺褐孔菌含有大量抗癌、降血壓、降血糖、復(fù)活免疫作用的植物纖維類多糖，因此樺褐孔菌的分離、純化以及藥效學研究很有意義[23-25]。

本研究比較了活性炭粉、過氧化氫、殼聚糖、聚酰胺層析柱對樺褐孔菌多糖脫色效果。聚酰胺層析柱是較好的方法，聚酰胺用量為粗多糖的8倍、采用1.5倍柱體積的去離子水以1.0 mL/min的流速進行洗脫時，聚酰胺層析柱的脫色率為89.3%、多糖保留率為91.7%。

本研究采用PMP柱前衍生化HPLC法分析樺褐孔菌多糖的單糖組成。結(jié)果顯示，樺褐孔菌多糖主要含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖6種單糖。各單糖物質(zhì)的量比為（甘露糖：鼠李糖：葡萄糖：半乳糖：木糖：阿拉伯糖）為2.13：1.36：7.01：2.98：1：1.78。

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Decolorization and Monosaccharide Composition Analysis of Polysaccharides from Inonotus obliguus

XUAN Guang-shan, LI Qing, WANG Yan-bo
(Qingdao University of Science & Technology, Qingdao 266042, China)

In the present work, activated carbon powder, H2O2, chitosan, and polyamide column chromatography were compared for their effects in decolorizing Inonotus obliguus polysaccharides, and the decolorized polysaccharides were analyzed for monosaccharide composition by high performance liquid chromatography (HPLC) after derivatization with 1-pheny-3-methyl-5-pyrazolone. All decolorants were able to decolorize Inonotus obliguus polysaccharides, with activated carbon powder and polyamide column chromatography being more significantly effective than the other decolorants. The decolorization efficiency of polyamide column chromatography was 89.3% while retaining 91.7% of polysaccharides. The decolorized polysaccharides were mainly composed of mann ose, rhamnose, glucose, galactose, xylose, and arabinose with a molar ratio of 2.13:1.36:7.01:2.98:1:1.7 8.

Inonotus obliguus; polysaccharides; decolorizat ion; precolumn derivatization; component analysis

R931.6

A

1002-6630（2014）10-0207-05

10.7506/spkx1002-6630-201410039

2013-09-17

玄光善（1964—），男，教授，博士，研究方向為藥物分析。E-mail：xuan@qust.edu.cn