一株產L-木酮糖菌株的分離篩選及鑒定

張玉寶，趙祥穎，楊麗萍，韓延雷，劉建軍1,,*

（1.山東農業大學食品科學與工程學院，山東 泰安 271018；2.山東省獸藥添加劑工程技術研究中心，山東 濟南250306；3.山東省食品發酵工程重點實驗室，山東 濟南 250013）

一株產L-木酮糖菌株的分離篩選及鑒定

張玉寶1,2，趙祥穎3，楊麗萍3，韓延雷3，劉建軍1,3,*

（1.山東農業大學食品科學與工程學院，山東 泰安 271018；2.山東省獸藥添加劑工程技術研究中心，山東 濟南250306；3.山東省食品發酵工程重點實驗室，山東 濟南 250013）

通過初篩和復篩從土壤中分離獲得1株能夠轉化木糖醇生產一種稀有糖——L-木酮糖的芽孢桿菌ZN-14。利用該菌株的靜息細胞以20 g/L木糖醇為底物，在pH 9.0、37℃條件下轉化24 h，轉化率達到26.62%。通過對菌株ZN-14形態特征觀察、生理生化特性鑒定以及16S rDNA基因序列同源性的分析，將其鑒定為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）。

L-木酮糖；巨大芽孢桿菌；生物轉化

L-木酮糖（L-xylulose）是存在于多種生物體代謝途徑的戊酮糖[1]，其在自然界中濃度很低，是一種稀有糖?？诜﨤-木酮糖可以抑制腸道蔗糖酶和麥芽糖酶活性，能有效地抑制餐后血糖升高，是降血糖食品的理想活性成分[2]。此外，L-木酮糖可以作為其他稀有糖生產的前體物質。例如，L-木酮糖可以通過L-鼠李糖異構酶轉化生產L-木糖和L-來蘇糖[3]。顯然，為了更好地研究L-木酮糖在食品工業的應用，重要的第一步是批量生產L-木酮糖用于進一步研究。

國內目前還未見L-木酮糖的研究報道，國外主要以多元糖醇為原料，通過化學和生物法轉化而成。化學法以D-山梨糖醇為原料合成L-木酮糖[4]，但存在生產工藝復雜、副產物多及純化繁瑣等缺點。生物法轉化L-木酮糖主要集中在利用菌體靜息細胞氧化木糖醇生產L-木酮糖。迄今為止，僅發現噬夏孢歐文氏菌（后改名為菠蘿泛菌（Pantoea ananatis））[5]、產堿桿菌（Alcaligenes）[6]、蒼白芽孢桿菌（Bacillus pallidus）[7]3種細菌具有生物轉化木糖醇生產L-木酮糖的能力。在上述3種細菌體內發現一種新型木糖醇-4-脫氫酶又稱為L-木酮糖還原酶（EC 1.1.1.10），專一作用于D-蘇結構[8]，轉化木糖醇生產L-木酮糖而后經過一系列轉化進入糖酵解途徑[9]。本實驗從樹林采集土壤樣品，分離篩選到一株具有氧化木糖醇生產L-木酮糖的菌株并對其進行種類鑒定，旨在為進一步研究生物轉化法制備L-木酮糖提供新材料。

1 材料與方法

1.1 材料

參照土樣采集標準方法[8]采集土樣，26個土壤樣品分別采自濟南、泰安、淄博、威海、大同等地，采集時間均為2011年9月15日—10月10日。

1.2 培養基

富集培養基（g/L）：木糖醇10、酵母膏5、（NH4）2SO42.6、KH2PO42.4、K2HPO45.6、MgSO4·7H2O 0.1，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

平板分離培養基（g/L）：木糖醇10、酵母膏5、（NH4）2SO42.6、KH2PO42.4、K2HPO45.6、MgSO4·7H2O 0.1、瓊脂20，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

斜面培養基（g/L）：木糖醇10、酵母膏5、蛋白胨5、NaCl 5、瓊脂20，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

種子培養基（g/L）：木糖醇10、酵母膏5、蛋白胨5、NaCl 5，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

發酵培養基（g/L）：木糖醇30、酵母膏5、蛋白胨5、NaCl 5、KH2PO42.4、K2HPO45.6、MgSO4·7H2O 0.4、CaCl2·2H2O 0.03、MnSO4·H2O 0.04、FeSO4·7H2O 0.03，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

牛肉膏蛋白胨培養基（g/L）：牛肉膏5、蛋白胨10、NaCl 5、瓊脂20，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

1.3 試劑與儀器

木糖醇 山東福田藥業有限公司；L-半胱氨酸鹽酸鹽、咔唑（均為分析純） 天津市科密歐化學試劑有限公司；木酮糖（純度95%） 美國Sigma公司；乙腈（色譜純） 美國天地試劑公司。

UltiMate3000型高效液相色譜儀 美國戴安公司；XW-80A 漩渦混合器 上海精科實業有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋 上海亞榮生化儀器廠；BH-2 Olympus顯微鏡 日本奧林巴斯光學有限公司；Anke TDL-5-A臺式離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.4 方法

1.4.1 菌株的分離與篩選

1.4.1.1 平板分離

取1 g土樣于30 mL富集培養基中（250 mL三角瓶），37℃、180 r/min振蕩培養2 d。取1 mL培養液轉到新鮮富集培養基中，如此重復5次。富集樣品進行10倍系列稀釋，取10-4、10-6、10-8、10-10這4個稀釋濃度的菌液1 mL分別涂布分離培養基平板，每個稀釋度3個平板，37℃培養 2 d。從平板上挑取單菌落，轉接斜面保藏并進行菌種初篩。

1.4.1.2 菌種初篩

將分離得到的菌株斜面接種于30 mL發酵培養基中（250 mL三角瓶），37℃、180 r/min振蕩培養36 h。取培養液離心洗滌得到靜息細胞，加入10 mL質量濃度為20 g/L木糖醇溶液（稱取20 g木糖醇溶于1 L、pH 9.0的Tris-HCl緩沖液，下同）轉化24 h，離心10 min，上清液半胱氨酸咔唑法顯色[9]，以目測法選出呈藍紫色者，作為產L-木酮糖菌株，留作復篩用。

1.4.1.3 菌種復篩

將初篩所得菌株斜面取1環接種于30 mL種子培養基中，37℃、180 r/min培養16 h。然后吸取1 mL種子液接種于30 mL發酵培養基中，37℃、180 r/min振蕩培養24 h，每菌株平行3瓶。高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測轉化液中L-木酮糖含量，色譜柱：HYPERSIL C18柱（300 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：水-乙腈（體積比為20∶80）；流速：0.5 mL/min；檢測器：示差折光檢測器（RID，ShodexRI-100）；柱溫：50℃；進樣量：25 μL。使用圓盤旋光儀進一步檢測轉化液的旋光性。

1.4.2 酶活力和轉化率的測定

取10 mL培養24 h的培養液，于4℃、8 000 r/min離心10 min，得到菌體用Tris-HCl緩沖液（pH 9.0，50 mmol/L）洗滌2次，棄去上清即得到靜息細胞，加入10 mL木糖醇溶液，37℃、180 r/min反應1 h。然后于100℃沸水浴加熱2 min終止酶反應，待其冷卻后，離心10 min，取上清液，半胱氨酸咔唑法測定生成的L-木酮糖含量。

酶活力單位定義：在上述條件下，每毫升發酵液每分鐘產生1 μg L-木酮糖的酶量為1個酶活力單位，以U/mL表示。

式中：m為L-木酮糖質量/μg；V為發酵液體積/mL；t為反應時間/min。

轉化率計算：在上述條件下，以生成的L-木酮糖與底物木糖醇的質量之比表示。

1.4.3 生物量的測定

按細菌生長曲線的測定方法[8]，以660 nm波長處的光密度值表示。

1.4.4 菌種鑒定

1.4.4.1 形態特征觀察

將目的菌株在牛肉膏蛋白胨培養基上進行稀釋涂布，37℃培養箱中恒溫培養24 h，觀察并記錄其菌落特征；同時挑取平板上單菌落（37℃，24 h）進行革蘭氏染色，10×100倍油鏡觀察并記錄觀察菌體形態。

1.4.4.2 生理生化實驗

進行淀粉水解實驗、葡萄糖產氣實驗、V.P.實驗、檸檬酸鹽利用實驗、H2S實驗、硝酸鹽還原實驗、M.R.實驗、明膠水解實驗、糖醇類發酵，分別參照文獻[11-12]方法進行。

1.4.4.3 16S rDNA的克隆及序列測定

將菌株接種于種子培養基中，37℃振蕩培養16 h，收集菌體。按照UNIQ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒說明書操作。擴增引物序列：正向引物為5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’，反向引物為5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。取DNA模板1 μL，10×Taq緩沖液2.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，dNTP 0.5 μL，Taq聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，反應體系加超純水補足至25 μL。PCR擴增條件為94℃預變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火35 s，72℃延伸1 min，循環數35，72℃延伸8 min。UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒純化PCR產物后經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目標片斷。由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將測序結果在NCBI中用BLAST在線同源性查詢軟件與GenBank中已登錄的16S rDNA基因序列進行同源性比較，用系統發生推斷軟件包MEGA 5.1進行系統發育分析，并以Neighbor-Joining法構建系統發育樹，確定該菌株的分類地位。

2 結果與分析

2.1 菌種的分離純化

木糖醇是一種多數微生物不能利用的稀有糖醇，因此選擇木糖醇作為唯一碳源和能源，有利于直接分離篩選出具有多元糖醇氧化能力的菌株。樣品經富集培養后稀釋涂布平板，共分離得到菌種287株，初步確定這些菌株具有以木糖醇為唯一碳源和能源生長的能力，轉入斜面保藏以進行進一步篩選。

2.2 產L-木酮糖菌株的初篩

表1 土樣分離菌株的轉化能力Table 1 The biotransformation capacity of stains isolated from soil

采用搖瓶培養方法對分離得到的287株菌株進行產酮糖能力初篩，結果如表1，用半胱氨酸-咔唑法對轉化液進行顯色后，有16株菌株出現了的藍紫色變化，其中，藍紫色較深的菌株有4株，分別為ZK-3、ZK-4、ZN-14、ZP-8，表明可能出現較大量的L-木酮糖。將這4株作為復篩實驗用菌株。

2.3 產L-木酮糖菌株的復篩

表2 產 2 L-木酮糖菌株發酵及轉化結果Table 2 Formentation and biotransformation capacities of selected strains

對初篩所得菌株進行了搖瓶復篩，用HPLC檢測反應液中L-木酮糖含量。由表2可知，菌株ZN-14轉化液中L-木酮糖含量最高，達到5.32 mg/mL，轉化率為26.62%，酶活力為2.6 U/mL。10℃室溫檢測質量濃度為1 g/L轉化液，旋光性為左旋，旋光度為28°。菌株ZN-14轉化液HPLC圖譜、木酮糖標樣HPLC圖譜和木糖醇標樣HPLC圖譜見圖1、2（ZK-3、ZK-4、ZP-8菌株轉化液HPLC結果在此略去）。

圖1 菌株ZN-14靜息細胞轉化生產L-木酮糖的HPPLLCC圖譜Fig.1 HPLC profiles showing the production of L-xylulose by resting cells of ZN-14

圖2 2 L-木酮糖和木糖醇標樣HPLC圖譜PLCFig.2 HPLC profiles of mixed standards of L-xylulose and xylitol

2.4 菌種鑒定

2.4.1 菌株ZN-14形態學特征

菌株ZN-14在牛肉膏蛋白胨固體培養基上37℃倒置培養24 h后，菌落呈乳白色，個體較大，圓形，表面濕潤有光澤，不透明，無褶皺，邊緣整齊，如圖3所示。菌株ZN-14經結晶紫染色后顯微鏡下觀察菌體呈桿狀散布或成串分布，革蘭氏染色呈陽性，芽孢呈橢圓形，中生，孢囊不膨大，如圖4所示。

圖3 菌株ZN-14菌落培養特征Fig.3 Colonial characteristics of strain ZN-14

圖4 菌株ZN-14細胞形態圖（×11 000000）Fig.4 Morphological characteristics of strain ZN-14 (×1 000)

2.4.2 菌株ZN-14生理生化鑒定

表3 菌株ZN-14的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain ZN-14

對該菌株進行生理生化特征鑒定，結果見表3。菌株ZN-14能發酵葡萄糖、木糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇，葡萄糖產氣實驗、V.P.測定為陰性，H2S實驗、硝酸鹽還原實驗、M.R.實驗、檸檬酸鹽利用實驗、淀粉和明膠水解均為陽性。對照《常見細菌系統鑒定手冊》和《伯杰氏細菌鑒定手冊》，初步將菌株ZN-14歸入芽孢桿菌屬。

2.4.3 菌株16S rDNA序列測定與系統發育分析

為了進一步確定菌株ZN-14的分類學位置，PCR獲得菌株ZN-14的16S rDNA基因的部分片段，長度為800 bp，測定其16S rDNA基因序列。將該序列與美國國家生物信息中心收錄的DNA序列進行比對，發現ZN-14與芽孢桿菌屬的16S rDNA序列自然聚類。選取14株同屬內同源性高的不同菌株的16S rDNA基因序列進行分子系統發育分析，如圖5所示，ZN-14與巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）IAM13418聚成一分支，序列相似性高達99%，表明ZN-14與巨大芽孢桿菌的親緣關系最近。

圖5 菌株ZN-14及相關菌株16S rDNA基因序列分析聚類結果Fig.5 Phylogenetic tree of strain ZN-14 based on 16S rDNA sequences

3 結 論

從土壤中分離細菌樣品，以木糖醇為唯一碳源和能源，經過定向篩選，得到1株可氧化木糖醇轉化生產L-木酮糖的菌株ZN-14。利用該菌株的靜息細胞以木糖醇溶液（20 g/L，pH9.0）為底物在37℃轉化24 h，轉化率達到26.62%，酶活力為2.6 U/mL。通過對該菌株形態學特征觀察、生理生化特性鑒定以及16S rDNA基因序列同源性的分析，將其鑒定為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）。

生物法轉化木糖醇生產L-木酮糖的菌株已有報道，然而使用巨大芽孢桿菌靜息細胞轉化生產L-木酮糖未見相關研究，為生物轉化法制備L-木酮糖提供了新材料。靜息細胞轉化法應用于稀有糖生產同化學法相比，成本低、方法簡單、轉化率高并且沒有副產物的干擾。通過對菌株發酵和反應工藝條件的優化以及菌種改良等措施，進一步提高L-木酮糖的產量是我們今后工作的方向。

[1] GORO T, WAYPOON P, KENJI M, et al. Cloning and overexpression of the xylitol dehydrogenase gene from Bacillus pallidus and its application to L-xylulose production[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2010, 74(9): 1807-1813.

[2] HEINZ F, HERTEL S, VOGEL M. Composition to reduce the level of sugar in the blood: German, WO98/20882[P]. 1998-05-22.

[3] TOM B G, GORO T, KENJI M, et al. L-xylose and L-lyxose production from xylitol using Alcaligenes 701B strain and immobilized L-rhamnose isomerase enzyme[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2005, 36: 976-981.

[4] LARSON H W, BLATHERWICK N R, BRADSHAW P J, et al. Metabolism of L-xylulose[J]. Biological Chemistry, 1941, 138: 353-360.

[5] REED D, ROBERT M. Characterization of xylitol-utilizing mutants of Erwinia uredovora[J]. Applied and Environmental Microbiology , 1985, 49: 158-162.

[6] ANISUR R K, HIASHIRO T, KAORII Y, et al. Conversion of xylitol to L-xylulose by Alcaligenes sp. 701B-Cells[J]. Fermention Bioengineering, 1991, 72(6): 488-490.

[7] WAYPOON P, GORO T, KENJI M, et al. Production of L-xylulose from xylitol by a newly isolated strain of Bacillus pallidus Y25 and characterization of its relevant enzyme xylitol dehydrogenase[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2007, 40: 1206-1212.

[8] WAYPOON P, GORO T, KENJI M, et al. Polyol conversion specifi city of Bacillus pallidus[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2008, 72(1): 231-235.

[9] ANDERSON R L, WOOD W A. Pathway of L-xylose and L-lyxose degradation in Aerobacter aerogenes[J]. Biological Chemistry, 1962, 237: 296-303.

[10] 諸葛健, 王正祥. 工業微生物實驗技術手冊[M]. 北京: 中國輕工業出版社, 1994: 335-364; 383-400.

[11] DISCHE Z, BORENFREUND E. A new spectrophotometric method for the detection of keto sugars and trioses[J]. Biological Chemistry, 1951, 192: 583-587.

[12] DISCHE Z, SHETTLE L B. A new spectrophotometric test for the detection of methylpentose[J]. Biological Chemistry, 1951, 192: 579-582.

[13] 東秀珠, 蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊[M]. 北京: 科學出版社, 2001: 63-64.

[14] 布坎南R E, 吉本斯N E. 伯杰細菌鑒定手冊[M]. 中國科學院微生物研究所《伯杰細菌鑒定手冊》翻譯組, 譯. 北京: 科學出版社, 1984: 729-794.

[15] USVALAMPI A, KIVIHARJU K, LEISOLA M, et al. Factors a vecting the production of L-xylulose by resting cells of recombinant Escherichia coli[J]. Microbiol Biotechnol, 2009, 36: 1323-1330.

[16] 李良智, 芮新生, 萬屹東. 微生物及其酶法生產稀有L-戊糖[J]. 化工進展, 2007, 26(5): 750-753.

[17] ZAKARIA A. Production of natural rare pentoses using microorganism and their enzymes[J]. Electronic Journal of Biotechnology, 2001, 4: 103-111.

[18] TOM B G, GORO T, MASAAKI T, et al. A novel and complete strategy for bioproduction of rare sugars[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2004, 97: 89-94.

[19] BEST D. Rare monosaccharides and biologically active iminosugars from carbohydrate chirons[D]. Oxford: University of Oxford, 2010.

[20] REED D, ROBERT M. Production of D- and L-xylulose by mutants of Klebsiella pneumoniae and Erwina uredovoru[J]. Applied and Environmental Microbiologyl, 1985, 49: 158-162.

Isolation and Identification of a Novel L-Xylulose-Producing Strain

ZHANG Yu-bao1,2, ZHAO Xiang-ying3, YANG Li-ping3, HAN Yan-lei3, LIU Jian-jun1,3,*
(1. College of Food Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, China; 2. Shandong Veterinary Medicine Additive Engineering Technology Research Center, Jinan 250306, China; 3. Key Laboratory of Food and Fermentation Engineering of Shandong Province, Jinan 250013, China)

A bacterium numbered as ZN-14 with the ability for efficient oxidization of xylitol to L-xylulose, a rare ketopentose, was isolated and purified from soil samples, through primary isolation and secondary screening. We have employed this isolated strain for the production of L-xylulose from xylitol by a resting cell reaction at 37 ℃ and pH 9.0. After 24 h, L-xylulose was produced at a yield of 26.62% when 20 g/L xylitol was utilized as the precursor. The strain was identifi ed as Bacillus megaterium, based on the sequence analysis of 16S rDNA and the general morphological and biochemical characteristics.

L-xylulose; Bacillus megaterium; biotransformation

Q939.9

A

1002-6630(2014)01-0199-05

10.7506/spkx1002-6630-201401039

2012-12-18

張玉寶（1988—），女，碩士，研究方向為發酵工程。E-mail：zhangyubao0201@163.com

*通信作者：劉建軍（1962—），男，教授，博士，研究方向為資源微生物開發與利用。E-mail：liujj-2000@163.com