黑靈芝多糖對S-180荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞cAMP/PKA、IP3/Ca2+及DAG/PKC信號通路的影響

黃建琴，聶少平*，張莘莘，黃丹菲，朱科學，謝明勇

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

靈芝（Ganoderma lucidum）為擔子菌綱多孔菌科靈芝菌屬的藥食兩用高等真菌，是我國最具有研究價值的著名藥用真菌之一，也是一種新資源食品[1]。靈芝多糖是靈芝的主要活性成分，大量實驗證明，靈芝多糖具有免疫增強和抗腫瘤作用[2-4]。黑靈芝又為靈芝中的極品，對人體保健具有的藥用療效遠高于其他種類的靈芝[5]。

眾所周知，腫瘤的發生發展與免疫密切相關。目前，國內外大量研究表明靈芝多糖具有顯著的免疫調節活性[6-7]。實驗證明，黑靈芝多糖（polysaccharides fromGanoderma atrum，PSG-1）對體外培養的腫瘤細胞無直接抑制作用，也不能誘導腫瘤細胞凋亡，但對體內腫瘤有明顯的抑制作用[8]。但黑靈芝多糖抗腫瘤作用的確切機制，尤其是對巨噬細胞、NK細胞等的信號轉導過程有何影響尚不清楚[9]。本實驗利用腹水瘤S-180細胞建立荷瘤小鼠模型，收集S-180荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞，探討黑靈芝多糖對S-180荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）/細胞蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）、三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3)/Ca2+及甘油二酯（diacylglycerol，DAG）/蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）信號通路的影響，進而確定PSG-1對荷瘤小鼠巨噬細胞的激活作用，為研究PSG-1抗腫瘤分子機制提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

黑靈芝（Ganoderma atrum）采自江西贛南靈芝生產基地，PSG-1由本實驗制備，其純度＞99.8%。采用紅外光譜法、氣相色譜法、分子大小排阻色譜法、氨基酸分析儀以及高效液相色譜法測得該多糖主要由甘露糖、半乳糖以及葡萄糖組成，其物質的量的比為1∶1.28∶4.91，平均分子質量為1013kD[10]。

RPMI-1640培養基 北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清 美國HyClone公司；脂多糖 美國Sigma公司；小鼠IP3、DAG和cAMP ELISA試劑盒 上海西唐有限公司；鈣離子熒光探針試劑盒 碧云天生物技術研究所；Anti-PKA、Anti-PKC抗體 美國Abcam公司；Antiβ-actin辣根酶標記山羊抗小鼠IgG、辣根酶標記山羊抗兔IgG 北京中杉金橋生物技術有限公司。

電泳儀、凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；CO2培養箱、VARIOSKAN FLASH酶標儀 美國Thermo公司；超凈工作臺 吳江市凈化設備總廠；3K15-高速冷凍離心機 美國Sigma公司；高壓滅菌裝備 上海醫療器械廠。

1.2 細胞及動物

腹水瘤S-180細胞株，購于中國科學院上海細胞庫。

BALB/c清潔級小鼠30只，雌性，體質量（22±2）g，購自南昌大學醫學院動物房。

1.3 方法

1.3.1 動物的造模

用PBS將無菌收集的S-180細胞懸液濃度調節至1×106個/mL，用1mL一次性無菌注射器每只0.2mL接種于小鼠右肢腹溝處。靜養約1周后小鼠右肢處出現腫瘤塊，造模成功。

1.3.2 腹腔巨噬細胞的分離純化

造模成功后繼續靜養1周，待腫瘤塊如黃豆大小，取S-180荷瘤小鼠頸椎脫臼處死，放入碘伏3min，75%酒精中浸泡3min脫碘，用無菌注射器向腹腔注入5mL預冷的PBS緩沖液，用棉球輕柔腹部1～2min后吸取腹腔液于離心管中，重復沖洗腹腔3次，收集以上PBS，于1000r/min離心5min，棄上清沉淀物。再用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液重懸沉淀物并轉移至培養瓶中，置CO2培養箱（5% CO2、37℃）培養4h后，輕輕吸棄培養液，用PBS洗去未貼壁細胞，重復洗滌3次，即可得到純化的腹腔巨噬細胞[11-13]。

1.3.3 荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞上清液中IP3、DAG和cAMP含量的測定

按上述方法制備的S-180荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞懸液，臺盼藍拒染檢測其活性（＞95%），分別按每孔4×105個細胞接種于96孔細胞培養板中，補充培養液至200μL，在細胞中加入PSG-1使其終質量濃度為20、40、80、160μg/mL，每組設5個復孔。置CO2培養箱中培養24h，收集上清。采用夾心ELISA法測定IP3、DAG和cAMP含量，具體操作方法按照相應的試劑盒說明進行。

1.3.4 荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞內Ca2+含量測定

取腹腔巨噬細胞懸液按1×105個/mL細胞濃度接種于6孔板中，不同質量濃度PSG-1刺激24h后，收集細胞，參照Fluo-3 AM（鈣離子熒光探針）試劑盒說明處理收集的巨噬細胞，室溫下用PBS清洗細胞，再100μL PBS重懸細胞后避光保存，在流式細胞儀上檢測胞內鈣離子含量。

1.3.5 荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞PKA及PKC表達水平的測定

取不同質量濃度的PSG-1作用荷瘤小鼠巨噬細胞24h后，收集細胞，參照總蛋白提取試劑盒說明收集各組的蛋白，并用BCA法檢測蛋白含量。用Western blotting法測定PKA及PKC的表達量。在上樣緩沖液中煮沸5min進行變性，然后將每個樣品裝載到10%的SDS-PAGE，轉移到硝酸纖維素膜上，用5%奶粉在室溫下封閉1h，用一抗即抗PKA及抗PKC于4℃孵育過夜。TBST緩沖液洗滌后，在室溫下用適當的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體將膜孵育1h，再次洗滌后，用化學發光試劑覆蓋膜表面，ChemiDocXRS＋凝膠成像系統檢測PKA及PKC表達水平。實驗重復3次。

1.4 統計學分析

2 結果與分析

2.1 PSG-1對S-180荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞產生IP3、DAG和cAMP的影響

由表1可見，PSG-1在終質量濃度20～160μg/mL范圍內作用24h后可促進S-180荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞生成IP3、DAG和cAMP，并顯著高于模型對照組，呈一定的劑量相關性。

表1 PSG-1對荷瘤小鼠脾腹腔巨噬細胞產生cAMP、DAG及IP3的影響lTable 1 Effects of PSG-1 on cAMP, DAG and IP production in peritoneal macrophages of tumor-bearing mice

2.2 PSG-1對S-180荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞內Ca2+含量的影響

細胞內游離Ca2+是細胞內重要的信使，其主要貯存于胞內鈣庫（如肌細胞的肌漿網）和線粒體中。為了檢測PSG-1是否影響巨噬細胞內Ca2+濃度，用PSG-1作用荷瘤小鼠巨噬細胞24h后，流式細胞儀測定細胞內Ca2+含量。由圖1可知，與模型對照組相比PSG-1刺激后S-180荷瘤小鼠巨噬細胞內Ca2+濃度顯著增加，并呈劑量依賴性增強。其濃度依賴性關系如圖2所示。

圖1 PSG-1對荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞Ca2+濃度的影響Fig.1 Effects of PSG-1 on Ca2+ flux in peritoneal macrophages of tumorbearing mice

圖2 荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞Ca2+濃度對應的比例Fig.2 The corresponding proportion of Ca2+ flux in peritoneal macrophages of tumor-bearing mice

2.3 PSG-1對S-180荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞內PKA及PKC表達水平的影響

PKA和PKC在受體介導的信號傳遞過程中起著重要作用。PKA又稱依賴于cAMP的蛋白激酶A，是一種結構最簡單、生化特性最清楚的蛋白激酶。一般認為，真核細胞內幾乎所有的cAMP的作用都是通過活化PKA，從而使其底物蛋白發生磷酸化而實現的。PKC也是一種常見激酶，一般以非活性狀態存在于細胞質中。由圖3、4可知，隨著PSG-1質量濃度的增加，PKA及PKC表達水平增強，與模型對照組比較均有顯著增加。

圖3 PSG-1對荷瘤小鼠脾腹腔巨噬細胞PKA及PKC表達水平的影響Fig.3 Effect of PSG-1 on the protein expression levels of PKA and PKC in peritoneal macrophages of tumor-bearing mice

圖4 PKA及PKC表達量對應的灰度值（n=33）Fig.4 The corresponding gray values of the protein expression levels of PKA and PKC (n = 3)

3 討 論

目前腫瘤是嚴重危害人類生命的疾病之一，對人類的健康有很大危害，其死亡率居高不下，尋找有效的預防和高效抗腫瘤藥物，仍然是科研工作者面臨的重要挑戰。大量研究表明，機體的免疫功能與腫瘤的發生發展有密切的關系[14]。巨噬細胞是免疫效應細胞，具有多種免疫功能，包括免疫防御、免疫監視、免疫調節以及抗原呈遞等，在機體的免疫系統中起著重要作用。

早期研究表明，絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated proteinkinases，MAPKs）區主要受酪氨酸激酶（tyrosine kinase，PKT）、PKC和PKA等激酶刺激活化[15]，而MAPK又參與多糖激活巨噬細胞免疫應答[16]。所以，PKA及PKC參與多糖巨噬細胞免疫應答。PKA被cAMP活化后，在ATP的存在下調節細胞的物質代謝和基因表達，從而影響細胞的增殖和分化。PKC也在調節細胞增殖和改變細胞的離子通道方面發揮著重要的作用。研究表明，PKA和PKC介導的信號轉導途徑涉及到多種細胞的存活和增殖[17]。那么，PSG-1是否通過cAMP/PKA、IP3/Ca2+及DAG/PKC信號通路的活化作用于患病小鼠的腹腔巨噬細胞，從而改善患病小鼠的免疫能力，目前尚無報道，本實驗對此進行了探討。

cAMP是由腺苷酸環化酶催化ATP生成的；IP3和DAG由G-蛋白偶聯受體激活磷脂酶C生成IP3及DAG。DAG、IP3和cAMP是細胞內常見的第二信使，參與激活細胞內多個信號通路，引起級聯反應，進行細胞的應答。cAMP主要是通過蛋白脂磷酸化作用繼續傳遞信息，將代謝途徑中的一些靶蛋白中的絲氨酸或蘇氨酸殘基磷酸化，將其激活或鈍化[18-19]。這些被共價修飾的靶蛋白往往是一些關鍵調節酶或重要功能蛋白，因而可以介導胞外信號，調節細胞反應。實驗結果表明，荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞經PSG-1處理后cAMP濃度顯著升高，同時PKA表達量也顯著增加。由此可以推斷，PSG-1可以激活荷瘤小鼠巨噬細胞內cAMP/PKA信號通路。

IP3和DAG功能分別是開放胞內鈣庫、激活Ca2+途徑和在Ca2+和磷脂酰絲氨酸存在下激活PKC。以肌醇磷脂代謝為基礎的細胞信號系統，最大的特點是胞外信號被膜受體接受后，同時產生兩個胞內信使，分別激動兩個信號傳遞途徑即IP3/Ca2+和DAG/PKC途徑[20-21]。細胞信號轉導理論認為：IP3通過作用于內質網膜上特異的受體使其內部Ca2+釋放，引起胞內Ca2+水平的增加，從而啟動胞內Ca2+信號系統，即通過依賴Ca2+、鈣結合蛋白的酶類活性變化來調節和控制一系列的生理過程。DAG通過激活PKC，以磷酸化的形式對許 多蛋白質和酶類進行修飾，從而調節和控制另外一系列的生理過程。兩條途徑相輔相成，又互相約束。 同時兩條通路信號的強弱又可根據原始信號的不同特征在細胞內加以調節，而使細胞對這些外界 信號作出不同的反應。實驗結果發現，在PSG-1刺激下，荷瘤小鼠巨噬細胞產生IP3和DAG量增加，且細胞內Ca2+濃度及PKC表達量也顯著升高。由此可以說明，PSG-1可以啟動荷瘤小鼠巨噬細胞內IP3/Ca2+和D AG/PKC途徑。該兩條途徑在信號轉導的過程中可能共同協作，進而激活荷瘤小鼠的腹腔巨噬細 胞，但需要進一步深入研究。

綜上所述，在相關研究表明PSG-1具有體內抗腫瘤作用[8,22]及多糖對巨噬細胞 免疫應答作用的研究基礎上[16]，本實驗通過接種S-180于小鼠右腹股溝處建立荷瘤小鼠模型，無菌分離荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞用于研究PSG-1對細胞內的信號通路的影響，為進一步研究PSG-1抗腫瘤機制提供參考。結果顯示，PSG-1可以激活荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞內cAMP/PKA、IP3/Ca2+及DAG/PKC信號通路，從而使患病小鼠免疫細胞發生一系列抵抗腫瘤的反應。由此可以猜測，PSG-1通過作用于荷瘤小鼠巨噬細胞，激發細胞內不同的信號通路，提高機體免疫能力從而實現抗腫瘤作用。針對得出的實驗結果，本實驗室將進一步研究細胞內其他信號通路，最終確定PSG-1激活巨噬細胞的一系列通路。

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