pH值及底物對副干酪乳桿菌發酵生產苯乳酸的影響

王立梅，騰 宇，陳文飛，張 輝，儲開陽

（1.常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇 常熟 215500；2.蘇州市食品生物技術重點實驗室，江蘇 常熟 215500）

pH值及底物對副干酪乳桿菌發酵生產苯乳酸的影響

王立梅1,2，騰 宇1，陳文飛1，張 輝1，儲開陽1

（1.常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇 常熟 215500；2.蘇州市食品生物技術重點實驗室，江蘇 常熟 215500）

在7.5 L發酵罐中研究pH值及流加苯丙酮酸和葡萄糖對副干酪乳桿菌W2分批發酵產苯乳酸（phenyllactic acid，PLA）的影響。結果表明：發酵液初始pH值、底物葡萄糖和苯丙酮酸對菌體生長和產物產量都有影響。控制發酵液pH值為6.5，采用間歇流加苯丙酮酸及連續流加苯丙酮酸和葡萄糖，發酵36 h后PLA產量分別達到1.148 g/L和2.121 g/L，苯丙酮酸的轉化率分別為62.19%和47.2%，與分批發酵相比分別提高41.72%和161.53%。

副干酪乳桿菌；苯乳酸；苯丙酮酸；底物流加

苯乳酸（phenyllactic acid，PLA）是一種廣泛存在于乳酸菌發酵產品和蜂蜜中的有機酸[1]。研究證實PLA具有廣譜且高效的抗菌活力，可以有效抑制包括食源性致病細菌、酵母和霉菌等多種微生物的生長，并且可以替代抗生素用于家畜飼養[2-4]。PLA具有較寬pH值范圍、熱穩定性高、溶解性好、易于在各種食品體系中擴散、對人和動物細胞均無毒性等優點，為其在食品工業中的應用提供廣闊的前景[5-6]。

PLA生產包括化學合成法和發酵法。據報道[7-9]，能夠產生PLA的微生物包括霉菌、芽孢桿菌、丙酸菌和乳酸菌，其中多數乳酸菌都具備合成PLA能力。然而乳酸菌發酵過程中產生的有機酸，會抑制細胞生長和代謝產物形成[10]。另外，PLA是乳酸菌代謝產物苯丙氨酸的分解代謝產物，而苯丙氨酸在細胞內不會過量積累，因此限制了PLA的合成[11]。乳酸菌發酵生產PLA的關鍵是提高菌體濃度和PLA產量，因此維持發酵體系pH值穩定，并通過外源添加中間產物苯基丙酮酸可以顯著提高PLA產量[12]。

本研究以1株產苯乳酸副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）W2為出發菌株[13]，采用7.5 L發酵罐對發酵體系中pH值和底物流加進行優化，以期達到提高PLA發酵水平的目的。

1 材料與方法

1.1 菌種、試劑與培養基

1.1.1 菌種

副干酪乳桿菌（L. paracasei）W2，本實驗室篩選（中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏號CCTCC No. M209318）。

1.1.2 試劑

葡萄糖試劑盒 保定長城臨床試劑有限公司；苯乳酸及苯丙酮酸標準品 美國Sigma公司；苯丙酮酸 山東綠源天然原料有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

種子培養基（g/L）：葡萄糖20、酵母膏5、蛋白胨10、牛肉膏10、乙酸鈉5、K2HPO42、檸檬酸二銨2、MgSO4·7H2O 0.58、MnSO4·4H2O 0.25，吐溫-80 1mL/L，pH 6.5，121℃滅菌20 min。發酵培養基（g/L）：葡萄糖20、酵母膏5、蛋白胨15、乙酸鈉5、K2HPO42、檸檬酸二銨1.8、MgSO40.58、MnSO40.25、苯基丙酮酸3，吐溫-80 4 mL/L，pH 6.5～7.0，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

LC-20A高效液相色譜儀 日本Shimadzu公司；BioFlo110發酵罐 美國NBS公司；CR22GⅡ高速冷凍離心機 日本Hitachi Koki公司；DHG-9243BS-Ⅲ電熱恒溫鼓風干燥箱 上海新苗醫療器械制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養方法

種子培養：將活化后的菌種先接入種子培養基中，30℃靜止培養18 h，然后按體積分數5%接種量再接入500 mL發酵培養基中，同樣條件培養后備用。

初始pH值對苯乳酸產量的影響：將發酵培養基的初始pH值分別調整到4.5～8.5范圍內，于30℃、接種量10%條件下，在7.5 L發酵罐中發酵36 h，測定PLA產量與生物量。

分批發酵：按照上述確定的最佳初始pH值，于接種量10%、30℃條件下，在7.5 L發酵罐中發酵36 h，每3 h測定苯乳酸產量、葡萄糖含量、pH值與生物量。

恒定pH值發酵：在7.5 L發酵罐中裝入3 L發酵培養基，接種量10%，采用10 mol/L的NaOH控制pH值為6.5，每小時間歇攪拌2 min，攪拌轉速50 r/min，30℃發酵36 h。每3 h檢測葡萄糖含量、生物量和PLA產量。

補料發酵：補料發酵在7.5 L全自動發酵罐中進行，裝液量3 L，接種量10%，發酵溫度30℃，采用10 mol/L NaOH流加控制發酵液pH 6.5。補料從發酵6 h開始至發酵結束，間歇補料為每3 h流加苯丙酮酸（18 g/L）40 mL（總添加量為400 mL），最終發酵液體積3 900mL；連續補料苯丙酮酸質量濃度50 g/L，流加速率13 mL/h；連續補料葡萄糖質量濃度500 g/L，在發酵6～15 h葡萄糖流加量為8 mL/h，在15～36 h葡萄糖流加量為18 mL/h，最終發酵液體積4 340 mL。發酵罐攪拌速度為50 r/min。每3 h檢測葡萄糖含量、生物量和PLA產量。

1.3.2 分析方法

1.3.2.1 葡萄糖含量測定

采用葡萄糖氧化酶法，按照試劑盒說明書操作。

1.3.2.2 生物量測定

取50 mL發酵液離心后收集菌體，蒸餾水洗滌3次，于105℃干燥、稱質量。

1.3.2.3 PLA提取與測定

將發酵液離心，取上清液調整pH 2.0，然后加入2倍體積的乙酸乙酯萃取，減壓蒸發濃縮，得到PLA樣品，經0.22 μm纖維素膜過濾，取濾液進行HPLC測定。

HPLC條件：色譜柱C18柱，流動相A為0.05%三氟乙酸甲醇溶液，B為0.05%三氟乙酸水溶液，檢測波長210 nm，柱溫30℃，總流速1 mL/min，進樣量5 μL。

苯乳酸產率按下式計算。

2 結果與分析

2.1 初始pH值對PLA產量的影響

如圖1所示，發酵液初始pH值對副干酪乳桿菌W2菌體生長和代謝影響較大，初始pH值為6.5～7.0時有利于菌體生長和PLA積累，初始pH值呈酸性或堿性均不利于乳酸菌生長和代謝產物積累。

2.2 分批發酵

圖2 PLA分批發酵曲線Fig.2 Time course of fed-batch fermentation

由圖2可知，發酵前期，生物量和PLA產量隨時間延長呈指數增長，而葡萄糖質量濃度迅速下降，發酵9 h葡萄糖基本消耗盡，發酵液pH值降至4.1，菌體生長受到限制，生物量最高為3.014 g/L，PLA產量為0.811 g/L。

2.3 恒定pH值分批發酵

圖3 恒定pH值PLA分批發酵曲線Fig.3 Time course of fed-batch fermentation at a constant pH

pH值控制在6.5，考察恒定pH值對副干酪乳桿菌W2生長及其代謝產物的影響，結果如圖3所示。菌體的生長速率和PLA的合成量都得到提高，細胞濃度和PLA產量最高分別達到5.308 g/L和0.936 g/L，分別比未控制pH值時提高76.11%和15.56%，對數生長期從6 h延長到9 h。在發酵12 h，葡萄糖幾乎耗盡，細胞生長明顯受到抑制，產物合成受到限制。

2.4 恒定pH值間歇補料苯丙酮酸發酵

圖4 恒定pH值間歇補料苯丙酮酸發酵曲線Fig.4 Time course of PLA production with intermittent feeding of PPA at a constant pH

pH值控制在6.5，間歇流加苯丙酮酸對副干酪乳桿菌W2生長及其代謝產物的影響如圖4所示。發酵0～9 h，菌體生長迅速，隨后到達穩定期；葡萄糖含量迅速下降，12 h幾乎耗盡，細胞的生長受到限制；發酵0～18 h時，PLA的產量呈指數增長，18 h后增長趨勢減緩。苯丙酮酸添加明顯提高了PLA產量，36 h達到1.148 g/L，PLA產率為62.19%。

2.5 恒定pH值連續補料葡萄糖和苯丙酮酸

如圖5所示，發酵0～24 h，連續補料發酵中菌體細胞一直處于連續增長狀態，30 h時，菌體生物量達到最高5.945 g/L；發酵0～9 h時PLA產量迅速增加，然后呈緩慢上升趨勢，發酵36 h，產量達到2.121 g/L，比分批發酵分別提高了97.25%和161.53%，PLA產率為47.2%。

圖5 恒定pH值連續補料葡萄糖和苯丙酮酸發酵曲線Fig.5 Time course of PLA production with continuous feeding of both PPA and glucose at constant pH

3 結論與討論

本研究考察了在7.5 L發酵罐中控制恒定pH值及流加底物葡萄糖和苯丙酮酸對副干酪乳桿菌W2分批發酵生產PLA的影響。乳酸菌發酵產生的有機酸使發酵液pH值降低，會導致細胞生長環境的酸化，造成了所謂的“酸脅迫”。乳酸菌在酸環境脅迫下，應激產生一系列應激蛋白（UspA蛋白），使菌體迅速適應環境的變化[14]。有研究顯示，UspA蛋白是通過調節生物膜的形成、增加菌體的運動和黏附性、保護和修復DNA系統等功能來應對環境的脅迫以保護細胞，使菌體在逆境環境中存在[15-17]。酸脅迫嚴重影響細胞的生理活性，引起細胞膜的通透性、膜結構、穩定性發生變化，影響酶的活性，進而影響乳酸菌的生長及代謝[18-20]。通過控制發酵液pH值，副干酪乳桿菌W2的菌體濃度明顯增加，同時連續補料發酵36 h，生物量和PLA產量較分批發酵分別提高了97.25%和161.53%。但連續補料發酵過程中PLA產率明顯下降。苯丙酮酸是PLA生產過程中間產物，當苯丙酮酸濃度過高時，反應向苯丙氨酸反應方向進行[21]。通過進一步對發酵液的高效液相圖譜分析和對副干酪乳桿菌W2轉氨酶酶學性質研究（尚未發表）都發現當苯丙酮酸濃度過高時，苯丙氨酸含量明顯增加，不利于PLA的合成。因此，恰當的苯丙酮酸流加方法將有利于提高PLA產量。

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Effects of pH and Substrate Feeding on Phenyllactic Acid Production by Lactobacillus paracasei W2

WANG Li-mei1,2, TENG Yu1, CHEN Wen-fei1, ZHANG Hui1, CHU Kai-yang1
(1. School of Biotechnology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China; 2. Suzhou Key Laboratory of Food Biotechnlogy, Changshu 215500, China)

In this paper, the effects of initial medium pH and feeding of the substrates glucose and phenylpyruvic acid (PPA) on the production of phenyllactic acid (PLA) by Lactobacillus paracasei W2 in a 7.5 L fermentor were studied. The results indicated that all three factors generated corresponding effects on cell growth and PLA production. Two substrate feeding strategies, intermittent feeding of PPA and continuous feeding of both glucose and PPA were performed and the initial medium pH was set to 6.5. After 36 h of fermentation under these conditions, PLA production reached 1.148 g/L and 2.121 g/L, respectively, and the conversion rate of PPA reached 62.19% and 47.2%, respectively. In addition, in comparison with fedbatch fermentation, the PLA yield was enhanced by 41.72% and 161.53%, respectively.

Lactobacillus paracasei; phenyllactic acid; phenylpyruvic acid; substrate feeding

TQ921.3

A

1002-6630(2014)01-0163-04

10.7506/spkx1002-6630-201401032

2013-07-27

國家農業科研成果轉化資金項目（2013GB2C100176）；江蘇省科技支撐計劃項目（BE2011393）；蘇州科技支撐計劃項目（SN201130）；常熟市科技發展計劃項目（CN201220）

王立梅（1964—），女，教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：wlmqb@126.com