假單胞桿菌BS1 轉座突變及高產生物表面活性劑突變株初步篩選

侯巨梅 韓巍 國莉玲 劉銅 王彥杰

（1. 黑龍江八一農墾大學農業部農產品質量安全監督檢驗測試中心，大慶 163319；2. 黑龍江八一農墾大學農學院植物病理與應用微生物研究所，大慶 163319；3. 黑龍江八一農墾大學生命學院，大慶 163319）

生物表面活性劑（Biosurfactant）是從生物來源分離得到的一類具有降低表面張力、穩定乳化、增加泡沫穩定性等表面特性的物質，通常有親水基和親油基兩部分［1，2］。生物表面活性劑的表面活性與化學合成的表面活性劑相當，但具有可生物降解的優點，因而不會造成環境危害［3-5］。但是生物表面活性劑自被發現至今，由于受到較高生產成本的限制，只有少數產品走向市場，大多數產品仍處于試驗階段，并沒有進行規模化生產。特別是野生發酵菌株生物表面活性劑的產量非常有限，發酵生產的成本較高，導致其經濟效益低于化學合成表面活性劑，最終降低其市場競爭力［6，7］。

本研究小組在前期的工作中，從大慶的油井口分離、篩選到一株性能較好產生物表面活性劑的菌株，并通過生化指標和16S rRNA 鑒定為假單胞桿菌BS1［8］，雖然通過發酵條件的優化產生物表面活性劑的產量有明顯的提高，但是要應用于生產實際中還存在一定的距離。因此本研究以假單胞桿菌BS1為始發菌，利用轉座突變技術構建假單胞桿菌BS1突變體，篩選高產表面活性劑突變株，旨在為進一步應用于生產實踐及探索其分子代謝途徑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 野生型菌株假單胞桿菌BS1 為供試菌株，保存于植物病理與應用微生物研究所。大腸桿菌（E.coli）RR1（含轉座子Tn917 的載體pTV1-OK）由美國Florida 大學Crowley 教授惠贈。

1.1.2 培養基和緩沖液 LB 培養基（g/L）：胰化蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10，瓊脂18。緩沖液和高滲溶液：0.1 mol/L 磷酸二氫鈉（pH7.0）溶液為緩沖液，加入0.8 mol/L 甘露醇為高滲溶液。SMM原生質體穩定液（mol/L）：蔗糖0.5、MgC120.02，順丁烯二酸0.02，調pH6.5。融合劑：40%聚乙二醇（PEG-4000）的SMM 溶液。溶菌酶液用SMM 溶液配制，終濃度為1 mg/mL，過濾除菌備用。原生質再生培養基：SMM 溶液加1.5% 瓊脂。產生物表面活性劑的發酵培養基（g/L）：硝酸鈉1.5，硫酸銨1.5，磷酸氫二鉀1.0，硫酸鎂0.5，氯化鉀0.5，硫酸亞鐵0.01，氯化鈣0.002，蒸餾水1 000 mL，液體石蠟5%，pH7.0。

1.2 方法

1.2.1 抗生素敏感性檢測 供試菌株假單胞桿菌BS1 為始發菌，分別涂布在含（0、5、10、15 和20 μg/mL）紅霉素（Erm）的LB 培養基上，于37℃培養24 h，確定假單胞桿菌BS1 對紅霉素最敏感濃度。

1.2.2 質粒轉化 將供試菌株假單胞桿菌BS1 在固體LB 培養基上，于37℃活化24 h 后，挑取單菌落置于LB 培養基中于37℃、180 r/min 振蕩培養箱中培養，當生長至菌懸液OD600=0.8 時，離心收集菌體。菌體用磷酸緩沖液沖洗后懸浮于10 mL SMM 溶液中，然后加入10 mL 溶菌酶，混勻后于37℃保溫30 min，然后用4 000 r/min 離心10 min，棄上清液，用高滲緩沖液洗滌除酶，然后將原生質體懸浮于200 μL 高滲緩沖液中。加入1 μg 質粒pTV1-OK 和1.8 mL 40% PEG 溶液，置36℃水浴保溫處理2 min，4 000 r/min 離心10 min，收集菌體，將沉淀充分懸浮于2 mL SMM 溶液中，將原生質體涂布于原生質再生平板上（含50 μg/mL Kan，10 μg/mL Erm），28℃培養箱培養4 d。挑取從平板上長出的菌落，即為含質粒pTV1-OK 的菌體。

1.2.3 轉座誘變和突變體庫構建 挑取含質粒pTV1-OK 的轉化菌株，接種于LB 培養液中（50 μg/mL Kan 和10 μg/mL Erm）中，28℃搖床中培養（180 r/min）24 h 后取50 μL 于10 mL LB 溶液中置于41℃水浴過夜。培養液按1∶100 稀釋后涂布于Erm 單抗平板上進行培養。將長出的菌落分別點在Erm 單抗平板以及Erm、Kan 雙抗平板的對應位置，挑取在雙抗平板上未長而在Erm 單抗平板上長出的菌落，即為轉座的菌株。按以上方法進行多次誘導，并將轉座子接入含有Erm 的LB 中進行穩定性培養，然后轉入甘油中保存，構建假單胞桿菌BS1 轉座突變體庫。

1.2.4 誘變突變體驗證 將假單胞桿菌BS1 和突變體轉接到新鮮的LB 中培養，收集菌體，提取基因組，根據Tn917 序列已報道的引物Tn1：5'-AACGACGAAACTGGCTAA-3' 和Tn2：5'-AGATGGAGCTGTCGACTCAC-3' 進 行PCR 反 應［9］。PCR 反 應 體 系（25 μL）：Premix Taq 12.5 μL，DNA 模 板1 μL， 引 物Tn1 和 Tn2 各1 μL，ddH2O 9.5 μL。 PCR 擴增條件：94℃ 5 min；94℃ 1 min，52℃ 30 s，72℃ 2 min，共30 個循環；72℃ 10 min。PCR 反應后進行1.0%瓊脂糖電泳檢測。

1.2.5 高產表面活性劑突變體的篩選 將假單胞桿菌BS1 和轉座突變體在牛肉膏蛋白胨斜面上活化24 h 后，用無菌水配制成菌懸液（107cfu）；然后以3%的接種量將菌懸液接種于產生物表面活性劑的發酵培養基，置于30℃、180 r/min 振蕩培養箱中培養7 d 后，4 000 r/min 離心10 min 收集上清液，進行乳化（E24）性能測定，測定方法參考文獻［10］。假單胞桿菌BS1 為對照，試驗重復3 次，數據采用DPS7.05 分析。

2 結果

2.1 供試菌株對抗生素敏感性檢測

供試菌株假單胞桿菌BS1 分別接種于含有0、5、10、15 和20 μg/mL 紅霉素的LB 培養基上。結果（圖1）顯示，假單胞桿菌BS1 在5 μg/mL 紅霉素的LB 培養基上生長被部分抑制，在10 μg/mL 紅霉素的LB 培養基上生長能夠完全被抑制，因此10 μg/mL 紅霉素被確定為最佳篩選轉座突變體的濃度。

圖1 供試菌株對紅霉素敏感性檢測

2.2 突變體的獲得

用pTV1-OK 質粒對原生質進行轉化，在含有10 μg/mL 紅霉素和50 μg/mL 卡那霉素的原生質體再生平板上長出3 個菌株，通過反復轉接抗性平板培養，最終獲得3 株能夠在雙抗平板上穩定生長的菌株，這表明3 株轉化子含有pTV1-OK 質粒（圖2）。挑取其中一個陽性轉化子進行誘導轉座突變后，獲得了在雙抗平板上未長而在Erm 單抗平板上對應位置長出的菌落（圖3），結果表明在誘導過程中，溫敏型的pTV1-OK 質粒在41℃下過夜時不能復制，產生丟失，使菌株不能夠產生Kan 抗性，但是轉座子可以發生跳躍而插入到細菌的基因組，因此可以在Erm 單抗平板生長。通過多次轉化試驗一共獲得650個轉座突變體。

圖2 pTV1-OK 質粒轉化

2.3 突變體PCR檢測

圖3 轉座突變體的挑選

通過提取菌株假單胞桿菌BS1 及其5 個隨機挑取的轉座突變株的總DNA，根據已知引物，對5 個突變株進行了PCR 檢測。結果（圖4）顯示，所有突變株均能擴增出Tn917 中一段基因的片段（1 779 bp），與預期片段大小一致，表明Tn917 已成功插入基因組中，而野生菌沒有擴增出相應的條帶，說明在出發菌中沒有Tn917 的插入。

圖4 PCR 驗證Tn917 的插入

2.4 高產表面活性劑突變株篩選

通過對隨機挑取的24 株轉座突變體的乳化（E24）性能測定，發現大部分轉座突變體與供試菌株的值相差不大，其中突變體T12 的E24 值達到67%，明顯高于野生菌株，結果（圖5）表明獲得一株高產生物表面活性劑的突變體。

3 討論

圖5 野生菌株和轉座突變體的乳化（E24）性能測定

生物表面活性劑由微生物代謝產生，其種類繁多、結構復雜，是一類由脂肪鏈和肽鏈組成的具有兩親結構的微生物次級代謝產物——微生物脂肽。由于其特殊的分子結構和多種生物學功能，微生物脂肽在醫藥、食品、化妝品及微生物采油等多個領域中有重要的應用前景［11，12］。據報道，由紫紅諾卡氏菌（Nocardia rhodochrous）產生的海藻糖脂用于地下砂石中石油的回收，其回收率可提高30%［13］。從大慶油田分離的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtitles）ZW-3 可產生的脂肽生物表面活性劑，當使用于采油時可提高采收率912%。但是由微生物來生產表面活性劑普遍存在發酵步驟繁雜、產量低、成本高等特點，成為其應用的瓶頸。

假單胞桿菌BS1 是從大慶油田分離的一株產鼠李糖脂的菌株，前期試驗通過對培養碳源、接種量、溫度、pH 值、鹽濃度和培養基裝液量的條件的優化，使其鼠李糖脂產生量有明顯的提高，但是相對工業要求，其產量相對較低，在應用上還有一定的距離。為了更好的開發和利用該菌株，創建高效、高產、優質的假單胞桿菌BS1 品系成為擬要解決的問題。

轉座誘變育種是利用轉座子隨機插入基因組方式引起基因的突變而獲得一系列的重組子，通過篩選重組子獲得符合育種目標的菌株。它不僅具有速度快、收效大、方法簡單等優點，而且能夠有效改善菌種特性、提高產品質量和簡化工藝條件等特點。因此目前許多優良的微生物菌株是通過此方法獲得的。例如，Koch［14］利用轉座子誘變Pseudomonas aevuginosa 獲得了提高二倍產量的生物表面活性劑突變株。吳慧玲［15］利用雙親接合的方法將含有Tn5轉座子的質粒導入丁香假單胞菌大豆致病變種中，篩選出一株產冠菌素比出發菌高21 倍突變株。齊勇［16］通過轉座誘導方法，建立了攜帶轉座子Tn917的巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium1301）突變體庫，通過生物測試法篩選出產細胞分裂素比野生型菌株顯著提高突變體B1301-22。本研究也利用轉座突變獲得了650 個突變體庫，通過對隨機挑取的24個突變體的乳化性能測定，發現其中一株乳化性能比野生型有顯著提高。乳化性能是測定生物表面活性劑含量指標之一，這說明試驗可能獲得一株高產表面活性劑的突變株，同時也表明轉座突變能夠快速、有效創建高產生物表面活性劑假單胞桿菌BS1新品系，為利用該菌株進行工業化生產奠定基礎。

4 結論

本研究利用轉座誘變方法成功突變了假單胞桿菌BS1，構建了含650 個轉座突變體庫，結合PCR技術證明了Tn917 質粒成功插入該菌基因組中。通過對隨機挑取的24 個轉座突變體的E24 值測定，獲得一株乳化性能好的突變株，其E24 值高達67%。

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