達托霉素發(fā)酵培養(yǎng)基配方及30L罐工藝優(yōu)化

王秀琴，錢思宇，賈嘯靜，婁 忻，仲偉潭，時 蕾

（華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司 微生物藥物國家工程研究中心河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊050015）

達托霉素是一種能有效作用于耐藥菌的新型抗生素，通過阻礙細菌細胞壁的生成和破壞細菌細胞膜的功能等方式達到殺菌的目的。與傳統(tǒng)抗生素相比，達托霉素作用機制獨特，且不易產(chǎn)生耐藥菌［1－2］，臨床上對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）、耐萬古霉素金黃色葡萄球菌（VRSA）、耐萬古霉素腸球菌（VRE）、凝固酶陰性的葡萄球菌（CNS）等頑固耐藥菌有較強活性［3－4］，已成為近年來醫(yī)藥界的研究熱點，取得了顯著的成果［5－8］。

達托霉素產(chǎn)生菌為玫瑰孢鏈霉菌（Streptomyces roseosporus）。作者采用均勻設(shè)計法對前期篩選的高產(chǎn)菌種的發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，所得的最優(yōu)配方經(jīng)過連續(xù)5批的重復(fù)實驗驗證，再將該配方進行30L發(fā)酵罐放大，通過調(diào)整發(fā)酵參數(shù)對關(guān)鍵工藝進行了優(yōu)化。

1 實驗

1.1 菌株、培養(yǎng)基與儀器

玫瑰孢鏈霉菌（Streptomyces roseosporus）NU－1030，由微生物藥物國家工程研究中心菌種保藏庫提供。

種子培養(yǎng)基：糊精1%，葡萄糖0.5%，玉米漿0.5%，K2HPO4·3H2O 0.04%，MgSO4·7H2O 0.1%。

發(fā)酵培養(yǎng)基（以下稱“配方一”）：葡萄糖2%，淀粉1.3%，冷榨豆餅粉1.5%，蛋白胨1%，CaCO30.5%，MgSO4·7H2O 0.3%，前體癸酸鈉（癸酸與NaOH等摩爾耦合）0.8%。

搖床，美國NBS公司；超凈臺、離心機，國產(chǎn)；30L發(fā)酵罐，德國貝朗公司。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 搖瓶培養(yǎng)

種子培養(yǎng)：取生長好的斜面，用接種鏟挖塊1cm2左右接入種子瓶中，于28℃、220r·min－1培養(yǎng)36h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將搖瓶種子按4%的接種量接入250 mL裝量為40mL的發(fā)酵瓶中，于28℃、220r·min－1培養(yǎng)118h。

1.2.2 30L發(fā)酵罐放大

將搖瓶種子按8%接種量接入30L發(fā)酵罐中，溫度（27±1）℃，罐壓0.05MPa，空氣流量1∶1.2，攪拌速度300r·min－1。前體癸酸鈉的補料總量為0.8%，采取流加補料方式，發(fā)酵32h開始補料，至發(fā)酵結(jié)束前12h完成，發(fā)酵周期168h。

1.3 檢測方法

采用HPLC法［9］進行檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化

以配方一為對照，選取葡萄糖（X1）、淀粉（X2）、冷榨豆餅粉（X3）和蛋白胨（X4）為考察因素，以相對發(fā)酵效價為考核指標，進行4因素4水平U8（84）均勻設(shè)計實驗以優(yōu)化搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方，設(shè)計方案及結(jié)果見表1。

表1 均勻設(shè)計實驗方案及結(jié)果／%Tab.1 Experimental scheme and results of uniform design／%

采用均勻設(shè)計軟件V4.0對表1結(jié)果進行最優(yōu)回歸子集分析，得到相對發(fā)酵效價（Y）對葡萄糖（X1）、淀粉（X2）、冷榨豆餅粉（X3）、蛋白胨（X4）4個因素的回歸方程為：Y＝65.8＋39.2 X1－62.4 X3－11.5 X1X2＋23.8 X－7.5 X2X3＋24.1 X，R2＝0.9997，s＝0.8155。

對回歸方程各項參數(shù)的方差分析結(jié)果見表2。

表2 回歸方程的方差分析Tab.2 Variance analysis of regression equation

最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖（X1）2.0%、淀粉（X2）2.0%、冷榨豆餅粉（X3）0.5%、蛋白胨（X4）0.6%，相對發(fā)酵效價為160.7724%。

查表得F0.05（6，2）＝19.33，F(xiàn)值遠遠大于F0.05（6，2），均方和P值都合理，說明方程擬合度好，方程有極其顯著的意義，所得最優(yōu)配方有實際參考價值。

按最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方連續(xù)進行5批搖瓶驗證實驗，每批做5個平行，取平均值，以配方一為對照（發(fā)酵效價設(shè)為100%）。5批搖瓶驗證實驗的相對發(fā)酵效價分別為167%、172%、159%、161%、158%，平均為163%，較配方一高出63%。

2.2 30L發(fā)酵罐放大實驗及工藝優(yōu)化

2.2.1 最優(yōu)配方30L發(fā)酵罐放大實驗

按最優(yōu)配方進行30L發(fā)酵罐放大實驗。以配方一為對照（發(fā)酵效價設(shè)為100%），連續(xù)5批的相對發(fā)酵效價分別為121%、132%、125%、135%、126%，平均為128%，較配方一高出28%。

菌種進罐24h后開始監(jiān)測菌絲量，每4h測一次。兩種配方下菌絲量隨發(fā)酵時間的變化見圖1。

圖1 兩種配方下菌絲量隨發(fā)酵時間的變化Fig.1 Changes of hyphae quantities with time in the two mediums

從圖1可以看出，最優(yōu)配方進罐罐批的初始菌絲量高于配方一進罐的罐批，菌絲量達到最大值的時間也相對提前，同期的菌絲量也相對較高。

2.2.2 前體癸酸鈉補料起始時間與補料總量優(yōu)化

為進一步優(yōu)化工藝條件，對前體癸酸鈉的補料起始時間進行了考察，結(jié)果見表3。

表3 前體補料起始時間的確定Tab.3 Determination of the initial feeding time of precurson

由表3可知，在發(fā)酵28h時補加前體癸酸鈉，相對發(fā)酵效價比原補料方案（32h時開始補料）顯著提高。說明按優(yōu)化配方進罐，在發(fā)酵28h時開始補加前體更有利于目的產(chǎn)物的形成。因此，確定前體癸酸鈉的補料起始時間為發(fā)酵開始28h。

前體癸酸鈉補料總量對相對發(fā)酵效價的影響見表4。

表4 前體補料總量的確定Tab.4 Determination of total feeding amount of precurson

由表4可知，前體癸酸鈉的補料總量從0.8%提高到1.5%時，相對發(fā)酵效價大幅提升。說明前體癸酸鈉補料總量為1.5%最為適宜，太少不足以提供達托霉素生成所需的側(cè)鏈供應(yīng)，太多則會對菌體生長產(chǎn)生毒害，也不利于菌體的次級代謝。

綜上，確定達托霉素30L罐發(fā)酵工藝中前體癸酸鈉的補料起始時間為發(fā)酵開始28h，補料總量為1.5%。

2.2.3 最優(yōu)配方及工藝驗證實驗

按最優(yōu)配方及調(diào)整后的新工藝連續(xù)進行5批30L發(fā)酵罐放大實驗，結(jié)果穩(wěn)定，相對發(fā)酵效價分別為178%、185%、192%、171%、180%，平均為181%，較配方一高出81%。

3 結(jié)論

采用均勻設(shè)計法優(yōu)化達托霉素最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖2.0%、淀粉2.0%、冷榨豆餅粉0.5%、蛋白胨0.6%。將優(yōu)化配方于30L發(fā)酵罐放大并對發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化，優(yōu)化的發(fā)酵工藝為：前體癸酸鈉的補料起始時間為發(fā)酵開始28h，補料總量為1.5%。優(yōu)化后的工藝和配方的發(fā)酵效價較對照提高81%，對達托霉素的工業(yè)化生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。

［1］RAJA A，LABONTE J，LEBBOS J，et al.Fresh from the pipeline：Daptomycin［J］.Nat Rer Drug Discor，2003，2（12）：943－944.

［2］CUNHA B A，HAMID N，KESSLER H，et al.Daptomycin cure after cefazolin treatment failure of methicillin－sensitive Staphylococcus aureus（MSSA）tricuspid valve acute bacterial endocarditis from a peripherally inserted central catheter（PICC）line［J］.Heart Lung，2005，34（6）：442－447.

［3］TALLY F P，ZECKEL M，WASILEWSKI M M，et al.Daptomycin：A novel agent for Gram－positive infections［J］.Exp Opin Invest Drugs，1999，8（8）：1223－1238.

［4］JEU L A，F(xiàn)UNG H B.Daptomycin：A cyclic lipopeptide antimicrobial agent［J］.Clin Ther，2004，26（11）：1728－1757.

［5］盧文玉，聞建平，范晶華，等.癸酸抗性突變株流加發(fā)酵法生產(chǎn)達托霉素［J］.天津大學學報，2006，39（B06）：20－24.

［6］劉省偉，趙德.用均勻設(shè)計優(yōu)化達托霉素發(fā)酵培養(yǎng)基［J］.中國抗生素雜志，2011，36（3）：4－7.

［7］張智翔，段然，敬科舉，等.組合抗性篩選法選育達托霉素高產(chǎn)菌株［J］.中國抗生素雜志，2012，37（3）：202－206.

［8］王蓓，謝詳茂，陳俊勇，等.液態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)達托霉素的培養(yǎng)條件優(yōu)化研究［J］.中國抗生素雜志，2013，38（3）：204－207，213.

［9］DONALD B.Extractive purification of lipopeptide antibiotics：US，6716962［P］.2004－04－06.