茜素紅褪色法檢測分子印跡膜上血紅蛋白

李慕梓，李雨亭，徐青青，謝衛紅

（湖北工業大學輕工學部 發酵工程省部共建教育部重點實驗室，湖北 武漢430068）

分子印跡聚合物（MIP）是一類針對特定目標合成的具有特異性識別位點及孔穴的新型高分子材料，近年來發展迅速，已有多種蛋白質、糖類、農藥、藥物和氨基酸衍生物的分子印跡聚合物被研發出來，并在分離分析、固相萃取、化學傳感器、類酶催化、檢測指示和藥物釋放等方面得到開發利用[1－3］，作為仿生分子識別材料具有廣闊的應用前景。

血紅蛋白是蛋白質分子印跡技術常用的一種模板蛋白，血紅蛋白的檢測是評價分子印跡聚合物印跡效率的關鍵環節。血紅蛋白的測定方法有很多種，常規方法有紫外吸收法、Bradford法、雙縮脲法和熒光法等。其中雙縮脲法適用于定性的快速檢測，靈敏度較低，檢出限為5～160mg·mL－1，不適于微量蛋白質的檢測；Bradford法與紫外吸收法操作簡便，檢出限均為1μg·mL－1，但容易受到去污劑、表面活性劑等物質的干擾；熒光法的檢出限能夠達到3μg·mL－1，但由于能夠引起熒光猝滅的物質較多，因此對溶液體系要求較高[4－5］。另外，利用血紅蛋白是一種色素蛋白的性質也發展了如氰化高鐵法、十二烷基月桂酰硫酸鈉法等檢測方法。氰化高鐵法用到的氰化鉀試劑有劇毒；十二烷基月桂酰硫酸鈉法的檢出限為1μg·mL－1，顯色穩定、準確度較高，是醫學上較常用的血紅蛋白檢測方法[6］。應用最多的紫外吸收法雖然操作簡便，但該方法是間接檢測分子印跡聚合物上血紅蛋白，存在一定誤差。目前，直接檢測固相上血紅蛋白的方法比較少，如BCA法雖然能夠用于固定蛋白的檢測，但檢出限只能達到10μg·mL－1，而且無法區分分子印跡聚合物上的模板血紅蛋白和其它蛋白。因此，發展分子印跡聚合物上血紅蛋白的直接檢測方法十分必要。

血紅蛋白具有與辣根過氧化物酶相同的鐵卟啉輔基和相似的空間結構，可替代辣根過氧化物酶作為生物催化劑，用于以過氧化氫為氫受體的反應[7］。在堿性介質中，血紅蛋白作為辣根過氧化物模擬酶能夠催化過氧化氫產生羥基自由基加速茜素紅褪色[8］，鑒于此，作者建立了一種操作簡便、靈敏度高的直接檢測分子印跡膜上血紅蛋白的方法。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

牛血紅蛋白、四甲基乙二胺（TEMED）、N，N′－亞甲基雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷（Tris），Sigma公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、過硫酸銨，國藥集團化學試劑有限公司；甘氨酸，Canalab公司；過氧化氫，上海展云化學試劑有限公司；氨水，武漢聯堿廠；茜素紅，天津廣成試劑有限公司；氯化銨，Angus公司。

Lambda 35型紫外可見分光光度計，美國Perkin－Elmer公司；AL104型精密電子分析天平、DELTA 320型精密pH計，梅特勒－托利多儀器有限公司；K5200G型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；DYY－6C型雙穩定時電泳儀、24DN型迷你雙垂直電泳槽，北京六一儀器廠；MK－3型全自動多功能酶標儀，賽默飛科技；TS－1型數顯脫色搖床，常州奧華儀器有限公司。

1.2 血紅蛋白分子印跡膜的制備

按照凝膠度5%、交聯度3%的比例稱取194mg丙烯酰胺和6mg N，N′－亞甲基雙丙烯酰胺溶液溶于2mL PB緩沖溶液（0.01mol·L－1，pH＝6.3）中，超聲溶解后，加入2mL 1×10－4mol·L－1的血紅蛋白溶液，氮氣除氧30min，加入35μL 10%過硫酸銨與6 μL TEMED，催化過硫酸銨生成自由基[9］。將聚合液迅速轉入2塊玻璃板中，室溫聚合30min。聚合完成后將水凝膠聚合物切成直徑為1cm的圓形。非分子印跡聚合物（NIP）的制備除不加模板分子外，其余步驟同上。

模板蛋白的洗脫：洗脫液為Tris－Gly－SDS溶液[0.05mol·L－1Tris，0.2mol·L－1甘氨酸，1%（質量濃度）SDS］，采用電泳洗脫法[10］洗脫3h，隨即用PB緩沖溶液（0.01mol·L－1，pH＝6.3）反復洗滌3次（每次30min）以除去模板蛋白及殘留的洗脫液。

1.3 茜素紅褪色法檢測血紅蛋白濃度的原理

在堿性介質中，血紅蛋白作為辣根過氧化物模擬酶能夠催化過氧化氫產生羥基自由基加速茜素紅的褪色。由紫外可見分光光度計檢測茜素紅褪色前后的吸光度差值與血紅蛋白濃度在一定范圍內呈線性關系。因此，測量反應前后印跡膜上茜素紅溶液的吸光度差值，即可得到印跡膜上血紅蛋白濃度。

1.4 茜素紅褪色法檢測血紅蛋白濃度的方法

將 NH3－NH4Cl（500mol·L－1，pH＝10）緩沖溶液、一定濃度的茜素紅溶液、一定濃度的過氧化氫溶液、1×10－6mol·L－1的血紅蛋白溶液按1∶5∶3∶1的體積比混合[11］，室溫反應一定時間，測定其在540 nm處的吸光度值A。以不加血紅蛋白溶液作為空白，吸光度值為A0。計算吸光度差值△A＝A0－A。

依次考察反應時間、茜素紅濃度、過氧化氫濃度對催化反應的影響。

1.5 分子印跡膜上血紅蛋白濃度的測定

1.5.1 標準曲線的繪制

在1.5mL 離 心管中 依次加入 100μL NH3－NH4Cl緩沖溶液、500μL 1.0×10－4mol·L－1茜素紅溶液、300μL 1.0×10－3mol·L－1過氧化氫溶液、100 μL不同濃度的血紅蛋白溶液，室溫反應35min，用酶標儀測定其在540nm處的吸光度值。按1.4方法計算△A，以血紅蛋白濃度（c）為橫坐標、△A為縱坐標繪制標準曲線。

1.5.2 印跡膜上血紅蛋白濃度的檢測

配制濃度為5×10－5mol·L－1、1×10－5mol·L－1、5×10－6mol·L－1、1×10－6mol·L－1、1×10－7mol·L－1、1×10－8mol·L－1的血紅蛋白溶液，將洗脫了模板蛋白的分子印跡膜和非分子印跡膜分別置入其中，重結合完成后，將分子印跡膜和非分子印跡膜取出，放置妥當，按優化體系配方依次加入100μL NH3－NH4Cl緩沖溶液、500μL茜素紅溶液、300μL過氧化氫溶液，室溫反應35min。反應完成后迅速用排槍吸出200μL于96孔板中，于540nm處測定吸光度值，計算吸光度差值△A，以未重結合的分子印跡膜及非分子印跡膜作為空白。

2 結果與討論

2.1 血紅蛋白催化過氧化氫氧化茜素紅反應條件的優化

2.1.1 反應時間的確定（圖1）

圖1 反應時間對吸光度差值的影響Fig.1 The effect of reaction time on the absorbance difference

由圖1可知：隨著反應時間的延長，吸光度差值緩慢增大；當反應時間為35min時，吸光度差值最大，為0.0708；當反應時間超過35min后，吸光度差值迅速減小。因此，選擇適宜的反應時間為35min。

2.1.2 茜素紅濃度的確定（圖2）

由圖2可知，當茜素紅濃度為1.5×10－4mol·L－1時，吸光度差值最大。因此，選擇適宜的茜素紅濃度為1.5×10－4mol·L－1。

2.1.3 過氧化氫濃度的確定（圖3）

由圖3可知，當過氧化氫濃度為0.01mol·L－1時，吸光度差值最大。因此，選擇適宜的過氧化氫濃度為0.01mol·L－1。

圖2 茜素紅濃度對吸光度差值的影響Fig.2 The effect of concentration of alizarin red on absorbance difference

圖3 過氧化氫濃度對吸光度差值的影響Fig.3 The effect of concentration of H2O2on absorbance difference

2.2 分子印跡膜上血紅蛋白濃度的測定

2.2.1 茜素紅體系檢測血紅蛋白的標準曲線（圖4）

圖4 茜素紅體系檢測血紅蛋白的標準曲線Fig.4 The standard curve of hemoglobin determined by alizarin red reaction system

由圖4可知，在0.5×10－8～8×10－8mol·L－1范圍內，血紅蛋白濃度（c）與吸光度差值（△A）之間存在線性關系，擬合線性回歸方程為△A＝5.74×10－10c＋0.0173，相關系數R2＝0.9956。

2.2.2 分子印跡膜上血紅蛋白的濃度

以重結合血紅蛋白濃度為橫坐標、吸光度差值△A為縱坐標繪制分子印跡膜和非分子印跡膜的重結合血紅蛋白濃度與吸光度差值關系曲線，如圖5所示。

圖5 重結合血紅蛋白濃度與吸光度差值的關系曲線Fig.5 The relationship curves of hemoglobin recombined with absorbance difference

由圖5可知，重結合血紅蛋白濃度與吸光度差值呈正相關，且分子印跡膜的檢測信號強于非分子印跡膜。

進一步根據標準曲線得出血紅蛋白的吸附量，如圖6所示。

圖6 分子印跡膜和非分子印跡膜上血紅蛋白的飽和吸附曲線Fig.6 Saturated adsorption curves of hemoglobin on molecular imprinted membrane or non－molecular imprinted membrane

由圖6可知，分子印跡膜和非分子印跡膜上血紅蛋白的飽和吸附濃度均為1.0×10－6mol·L－1，此濃度下分子印跡膜上血紅蛋白的吸附量為8.52μg·mL－1，非分子印跡膜上血紅蛋白的吸附量為3.29μg·mL－1，印跡效率α達到2.7。

3 結論

（1）基于血紅蛋白作為辣根過氧化物模擬酶能夠在堿性介質中催化過氧化氫產生羥基自由基加速茜素紅褪色的原理，建立了分子印跡膜上血紅蛋白的檢測方法。優化的反應體系中茜素紅、過氧化氫的最佳濃度分別為1.5×10－4mol·L－1和0.01mol·L－1，反應時間為35min。以丙烯酰胺凝膠包埋血紅蛋白制備分子印跡聚合物，并用優化后的體系對分子印跡膜上結合血紅蛋白的濃度進行了測定。結果表明，重結合血紅蛋白濃度與茜素紅吸光度差值呈正相關。

（2）與其它方法相比，茜素紅褪色法的檢出限較低，能夠檢測到0.3μg·mL－1（5×10－9mol·L－1）的血紅蛋白，由于只有具有活性的血紅蛋白才能被測得，因而這種在固相印跡聚合物上檢測血紅蛋白的方法不僅能夠測定血紅蛋白的濃度，而且能夠直觀地表現所測蛋白的性質，在快速檢測元件的發展中具有極大的潛力。

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