鄰苯二甲酸單丁酯致小鼠肝臟和腎臟組織的氧化損傷

劉志敏，熊 棣，曹鳳華，梅宇飛，吳 卓，楊 旭，袁均林

（華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)湖北省重點實驗室，湖北 武漢430079）

從20世紀(jì)30年代至今，鄰苯二甲酸酯（PAEs）主要作為增塑劑大量存在于日常生活中，主要作用是軟化塑料和增強塑料的彈性。由于此類材料不是以共價鍵與終產(chǎn)物結(jié)合，可不斷釋放至土壤、水和大氣中，造成環(huán)境污染［1－2］。鄰苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）是使用量最大、污染最嚴(yán)重的PAEs［3］。檢測尿液中PAEs的代謝物發(fā)現(xiàn)，DBP的人體內(nèi)暴露水平最高［4］。由于PAEs在環(huán)境中普遍存在，其一級代謝物鄰苯二甲酸單丁酯（MBP）在一些環(huán)境中也被發(fā)現(xiàn)。研究表明，MBP生物活性更高、毒性更大，不僅對生殖、發(fā)育、體內(nèi)激素、核受體、炎癥和肥胖等方面都能產(chǎn)生影響，甚至還可以致死、致畸、致突變［5］，成為PAEs毒性研究的新熱點［6－10］。

近年來，國外科學(xué)家通過測定尿液中PAEs的代謝物MBP的含量間接反映PAEs的內(nèi)接觸水平，并基于尿液樣品的易得性和檢測方法的成熟度，認(rèn)為MBP是一種較為合適的反映PAEs暴露的生物標(biāo)志物。對尿液中MBP的研究為評價PAEs在人體的暴露量及對人體健康的影響提供了重要的信息［11－13］。

作者在此對MBP引起的小鼠肝臟和腎臟組織的氧化損傷進行研究，擬為全面評價PAEs對人體健康的影響提供更豐富的信息，也為全面了解PAEs毒性提供依據(jù)。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

SPF級雄性BALB／c小鼠，購于湖北省預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實驗中心。

鄰苯二甲酸單丁酯（純度≥98.5%）、DCFH－DA熒光染料（純度＞99.9%），Sigma公司；硫代巴比妥酸（TBA）、5，5′－二硫代二硝基苯甲酸（DTNB），分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

5415R型低溫冷凍離心機，德國Eppendorf公司；MS1Minishaker型渦旋儀，德國IKA公司；FLx800型熒光酶標(biāo)儀，美國Bio－Tek儀器有限公司；DNM－9602型酶標(biāo)分析儀，北京普朗新技術(shù)有限公司；JN－3200DT型超聲處理器，寧波江南儀器廠。

1.2 動物分組和染毒

對42只4周齡SPF級雄性BALB／c小鼠先進行1周的實驗室環(huán)境飼養(yǎng)，1周后隨機分為7組，每組6只：空白對照組，溶劑對照組，25mg·kg－1MBP染毒組，50mg·kg－1MBP染毒組，100mg·kg－1MBP染毒組，200mg·kg－1MBP染毒組，100mg·kg－1DBP染毒組。MBP、DBP均用金龍魚調(diào)和油進行配制，每天定時對小鼠給予0.005mL·（g體重）－1灌胃1次，染毒14d。溶劑對照組以等體積的金龍魚調(diào)和油進行灌胃，染毒期間小鼠均可自由進水、進食。

1.3 染毒期間小鼠體征的觀察

觀察并記錄染毒期間7組小鼠的體征變化，并記錄染毒期間7組小鼠的平均體重。

1.4 肝臟、腎臟組織切片觀察

染毒結(jié)束后，取小鼠部分肝臟和一側(cè)的腎臟，用10%的甲醛固定，脫水，透明，浸蠟，包埋，切片，HE染色，在顯微鏡下觀察組織的病理學(xué)變化。

1.5 組織勻漿液的制備

分別快速取出小鼠肝、腎，先用冰冷的PBS緩沖溶液漂洗，然后稱取適量，加入10BV的PBS緩沖溶液（pH＝7.5）制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的勻漿液，低溫離心后取上清液，用于活性氧（ROS）、還原性谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）含量的測定。

1.6 ROS含量的測定

參照Crow［10］的方法并稍加改進。分別取小鼠肝臟和腎臟組織勻漿上清液2μL，加入198μL PBS緩沖溶液稀釋100倍；取100μL排列于酶標(biāo)板中，然后加入100μL熒光染料染色，避光反應(yīng)5min，用熒光酶標(biāo)儀檢測，以熒光強度表征ROS含量。空白組為100μL PBS緩沖溶液加100μL熒光染料。

1.7 GSH含量的測定

參照Anderson［14］方法并稍加改進。分別取小鼠肝臟和腎臟組織勻漿上清液200μL，加入有機溶劑（V氯仿∶V正丁醇＝4∶1）1mL，用渦旋儀混合均勻，在冰上靜置10min后10 000×g離心5min；在不破壞蛋白層的情況下取上清液50μL加入酶標(biāo)板，加150μL濃度為60ng·mL－1的DTNB，室溫下避光反應(yīng)5 min，測其在412nm處的吸光值（OD412）。空白組為50mL PBS緩沖溶液加150μL DTNB。

1.8 MDA含量的測定

參照Draper等［15］方法并稍加改進。分別取500 μL肝臟和腎臟組織勻漿上清液于試管中，加入2mL 0.6%TBA，沸水浴15min；取上清液1mL于EP管中，10 000×g離心5min；取上清液100μL于酶標(biāo)板中排列，用全波長酶標(biāo)儀檢測，分別在450nm、532nm和600nm波長下測定吸光值（以加PBS緩沖溶液的空白組為對照）。按公式c＝6.45（OD532－OD600）－0.56OD450計算MDA的含量。

1.9 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用Origin6.1統(tǒng)計軟件進行檢驗處理，比較染毒組與對照組測量值的差異：P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 染毒期間小鼠體征的變化

實驗發(fā)現(xiàn)：染毒前2d，各實驗組小鼠進食、進水正常，無中毒癥狀及體征變化；染毒后第3～15d，與對照組相比，各染毒組存活小鼠依據(jù)染毒劑量的高低分別出現(xiàn)不同程度的中毒癥狀如輕微精神不振、行動遲緩、食欲下降、皮毛無光澤等，低劑量組小鼠體重總體仍呈上升趨勢，而100mg·kg－1MBP、200mg·kg－1MBP和100mg·kg－1DBP染毒組體重均呈下降趨勢，且最高劑量染毒組體重下降最為明顯，體重相差最大的一只小鼠從染毒第1d的31.07g下降到第14d的24.36g，且皮毛呈炸起狀，身體發(fā)青，在每天換墊料與清洗鼠籠的情況下，皮毛仍為濕漉狀態(tài)且局部粘連，并伴有刺激味道。

小鼠在接觸MBP過程中所出現(xiàn)的中毒癥狀隨著染毒劑量的增加越來越明顯，說明MBP引起了小鼠不同程度的機體損傷。

2.2 小鼠肝臟組織切片觀察（圖1）

染毒14d后，在顯微鏡下觀察經(jīng)HE染色的小鼠肝臟組織細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞的損傷程度與染毒劑量水平呈明顯的劑量－效應(yīng)關(guān)系，200mg·kg－1MBP染毒組小鼠肝細(xì)胞病變最為明顯。

由圖1可看出：對照組的肝細(xì)胞以中央靜脈為中心向外呈輻射狀排列，肝竇狀隙規(guī)則分布（圖1a、b）；100mg·kg－1MBP染毒組（圖1e）和200mg·kg－1MBP染毒組（圖1f）部分肝細(xì)胞水腫、細(xì)胞核固縮、破裂、水解、胞漿空亮、核消失、空泡樣變、脂肪滴增大融合、局部細(xì)胞嚴(yán)重壞死，說明肝細(xì)胞存在嚴(yán)重的氧化損傷；25mg·kg－1MBP染毒組（圖1c）和50mg·kg－1MBP染毒組（圖1d）肝細(xì)胞質(zhì)地相對均勻，局部伴隨輕微炎癥細(xì)胞浸潤、細(xì)胞核輕微固縮、局部胞漿空亮和局部細(xì)胞腫大等癥狀。

相關(guān)研究表明MBP在體內(nèi)的生物活性并不降低，故本實驗另設(shè)染毒組DBP，與相同劑量的MBP染毒組比較氧化損傷程度。與100mg·kg－1MBP染毒組（圖1e）比較，100mg·kg－1DBP染毒組（圖1g）出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞水腫和細(xì)胞核固縮，但100mg·kg－1MBP染毒組細(xì)胞核固縮、細(xì)胞水腫、空泡樣變等癥狀比100mg·kg－1DBP染毒組嚴(yán)重。

圖1 不同處理組對小鼠肝臟的病理組織學(xué)影響（HE×200）Fig.1 Effects of different treatment groups on the histopathology of mice liver（HE×200）

2.3 小鼠腎臟組織切片觀察（圖2）

圖2 不同處理組對小鼠腎臟的病理組織學(xué)影響（HE×200）Fig.2 Effects of different treatment groups on the histopathology of mice kidney（HE×200）

在顯微鏡下觀察經(jīng)HE染色的腎臟組織細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)，與肝臟組織細(xì)胞相比，腎臟組織細(xì)胞只發(fā)生輕微的變化，小鼠腎臟組織損傷程度與染毒劑量水平無明顯的劑量－效應(yīng)關(guān)系。

由圖2可以看出，100mg·kg－1MBP染毒組（圖2e）和200mg·kg－1MBP染毒組（圖2f）與對照組（圖2a）比較，出現(xiàn)了局部腎小管上皮細(xì)胞脫落于管腔、水樣變性等癥狀，但小鼠腎臟病理切片可見腎皮質(zhì)和髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，系膜區(qū)無增生及沉積物，基底膜未見病變；隨著染毒劑量的增加，出現(xiàn)了腎小體數(shù)目減少、腎小囊管腔變窄、淋巴細(xì)胞浸潤程度增大等癥狀。

100mg·kg－1MBP染毒組（圖2e）和100mg·kg－1DBP染毒組（圖2g）相比沒有明顯差別，但與對照組相比，細(xì)胞腎小囊管腔均變窄，出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤等癥狀。

2.4 小鼠肝臟和腎臟組織中ROS含量的變化

小鼠經(jīng)不同處理后，肝臟和腎臟組織中ROS含量的變化如圖3所示。

圖3 不同處理組對小鼠肝臟和腎臟組織ROS含量的影響Fig.3 Effects of different treatment groups on ROS content in liver and kidney of mice

由圖3可知：（1）MBP劑量為25mg·kg－1和50 mg·kg－1時，染毒組肝臟組織ROS含量與對照組無顯著性差異（P＞0.05）；劑量為100mg·kg－1和200 mg·kg－1時，染毒組肝臟組織ROS含量與對照組有極顯著性差異（P＜0.01）。表明染毒劑量≥100mg·kg－1時MBP可致小鼠肝臟組織ROS含量上升；（2）MBP劑量為25mg·kg－1和50mg·kg－1時，染毒組腎臟組織ROS含量與對照組有顯著性差異（P＜0.05）；劑量為100mg·kg－1和200mg·kg－1時，染毒組腎臟組織ROS含量與對照組有極顯著性差異（P＜0.01）。表明染毒劑量≥25mg·kg－1時MBP可致小鼠腎臟組織ROS含量上升；（3）相同劑量的MBP和DBP染毒組相比，MBP染毒組肝臟組織ROS含量顯著高于DBP染毒組（P＜0.05），MBP染毒組腎臟組織ROS含量略高于DBP染毒組，但無顯著差異（P＞0.05）。

2.5 小鼠肝臟和腎臟組織中GSH含量的變化

小鼠經(jīng)不同處理后，肝臟和腎臟組織中GSH含量的變化如圖4所示。

圖4 不同處理組對小鼠肝臟和腎臟組織GSH含量的影響Fig.4 Effects of different treatment groups on GSH content in liver and kidney of mice

由圖4可知：（1）MBP劑量為25mg·kg－1、50 mg·kg－1、100mg·kg－1和200mg·kg－1時，染毒組肝臟組織GSH含量與對照組均有極顯著性差異（P＜0.01）。表明染毒劑量≥25mg·kg－1時MBP可致小鼠肝臟組織GSH含量下降；（2）MBP劑量達(dá)到100 mg·kg－1時，染毒組腎臟組織GSH含量與對照組出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）；劑量增加到200mg·kg－1時，染毒組腎臟組織GSH含量與對照組出現(xiàn)極顯著性差異（P＜0.01）。表明染毒劑量≥100mg·kg－1時MBP可致小鼠腎臟組織GSH含量下降；（3）相同濃度的MBP和DBP染毒組相比，肝臟和腎臟組織GSH含量均無顯著性差異（P＞0.05）。

2.6 小鼠肝臟和腎臟組織中MDA含量的變化

小鼠經(jīng)不同處理后，肝臟和腎臟組織MDA含量的變化如圖5所示。

圖5 不同處理組對小鼠肝臟和腎臟組織MDA含量的影響Fig.5 Effects of different treatment groups on MDA content in liver and kidney of mice

由圖5可知：（1）MBP劑量為25mg·kg－1時，染毒組肝臟組織MDA含量與對照組無顯著性差異（P＞0.05）；劑量為50mg·kg－1、100mg·kg－1時，染毒組肝臟組織MDA含量與對照組有顯著性差異（P＜0.05）；劑量為200mg·kg－1時，染毒組肝臟組織MDA含量與對照組有極顯著性差異（P＜0.01）。表明染毒劑量≥50mg·kg－1時MBP可致小鼠肝臟組織MDA含量上升；（2）MBP劑量為25mg·kg－1、50 mg·kg－1和100mg·kg－1時，染毒組腎臟組織MDA含量與對照組無顯著性差異（P＞0.05），劑量為200 mg·kg－1時，染毒組腎臟組織MDA含量與對照組出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。表明染毒劑量≥200mg·kg－1時MBP可致小鼠腎臟組織MDA含量上升；（3）相同劑量的MBP和DBP染毒組相比，MBP染毒組肝臟和腎臟組織的MDA含量比DBP染毒組含量略高，無顯著性差異（P＞0.05）。

2.7 討論

ROS是超氧陰離子自由基、過氧化氫、羥基自由基和脂質(zhì)過氧化的不穩(wěn)定中間體的統(tǒng)稱，大部分ROS超過一定濃度時會對其它生物分子產(chǎn)生不利影響［16］。MBP引起的ROS含量上升與其對肝臟和腎臟的促炎癥效應(yīng)有直接關(guān)系，因此ROS的生成和氧化應(yīng)激反應(yīng)是解釋MBP造成肝臟和腎臟炎癥的主要方式。實驗表明，在染毒劑量≥100mg·kg－1和≥25mg·kg－1時，MBP可分別導(dǎo)致小鼠肝臟和腎臟組織ROS含量上升。

除抗氧化性的酶外，GSH提供了抵抗ROS的第一道防線，不僅能清除自由基及降低過氧化氫水平，還能修復(fù)由自由基引起的生物學(xué)損傷。當(dāng)細(xì)胞GSH含量降低到一定程度時，細(xì)胞會受到不可逆損傷［17］。因此GSH的含量是反映細(xì)胞狀態(tài)的標(biāo)志之一。實驗表明，在染毒劑量≥25mg·kg－1和≥100mg·kg－1時，MBP可分別導(dǎo)致小鼠肝臟和腎臟組織GSH含量下降。可能是由于持續(xù)的MBP的氧化應(yīng)激產(chǎn)物ROS所引起，同時GSH由于去除過氧化氫而被消耗減少［18］。

研究表明，隨著自由基的增加，細(xì)胞毒性也逐漸增大。同時，自由基引起脂類的連續(xù)氧化反應(yīng)導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增加。MDA是較典型的脂類氧化的分解產(chǎn)物，MDA的含量可以衡量脂類氧化的程度，間接反映引起脂類氧化的活性氧水平［19］。實驗表明，在染毒劑量≥50mg·kg－1和≥200mg·kg－1時，MBP可分別導(dǎo)致小鼠肝臟和腎臟組織MDA含量上升，使小鼠肝臟和腎臟活性氧水平上升，是MBP毒性損傷的顯著性表現(xiàn)。綜上，在MBP的濃度達(dá)到一定量的情況下，小鼠肝臟和腎臟組織中可能會產(chǎn)生過量的活性氧自由基，這些自由基可以作用于生物膜，也可以作用于蛋白質(zhì)等發(fā)揮破壞作用。與先前Prasanth等［8］報道的DBP和MBP對SOD的抑制作用削弱了自由基的清除機制，引起機體氧化損傷，對身體有不利影響的結(jié)果相吻合。

相同濃度的MBP和DBP染毒組相比，除了在肝臟中的ROS含量MBP染毒組顯著高于DBP染毒組外，GSH和MDA的含量均無顯著性差異，這證明了在100mg·kg－1的濃度下MBP在體內(nèi)的生物活性并不降低，與趙雅輝等［5］的結(jié)論是一致的。

實驗還發(fā)現(xiàn)，高劑量MBP染毒組有2只小鼠的肝臟和腎臟組織MDA含量在反復(fù)測量的情況下仍有明顯下降趨勢，因此推測，小鼠肝臟和腎臟組織MDA含量的變化與ROS的變化并不完全符合對應(yīng)關(guān)系，提示在導(dǎo)致組織細(xì)胞過氧化的過程中還存在其它作用機制。

3 結(jié)論

為了探究鄰苯二甲酸單丁酯（MBP）對小鼠肝臟和腎臟的氧化損傷，將42只BALB／c小鼠隨機分為7組，每組6只，分別為25mg·kg－1、50mg·kg－1、100 mg·kg－1、200mg·kg－1的4個MBP染毒組、1個100mg·kg－1的鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）染毒組、1個空白對照組、1個溶劑對照組。染毒期間對小鼠的體征進行觀察；14d后取其肝臟和腎臟組織，制作小鼠肝臟和腎臟組織的切片，對肝臟和腎臟的組織學(xué)形態(tài)進行觀察；制作組織勻漿液用于檢測肝臟和腎臟組織細(xì)胞的ROS、GSH、MDA的含量，以了解MBP對肝臟和腎臟組織的氧化損傷作用。結(jié)果顯示：各劑量組小鼠肝細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞核固縮、細(xì)胞水腫、空泡樣變、脂肪滴增大融合等癥狀；ROS和MDA的含量與MBP的染毒劑量呈正相關(guān)，GSH的含量與MBP的染毒劑量呈負(fù)相關(guān)；相同劑量的DBP與MBP染毒組相比，MBP染毒組的ROS和MDA含量較高、GSH含量較低。表明，MBP的暴露與小鼠肝臟和腎臟組織的氧化損傷存在直接聯(lián)系。

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