尼古丁污染及其微生物降解研究進展

焦 洋，何厚龍，柳華貴，鐘衛鴻

（浙江工業大學生物與環境工程學院，浙江 杭州310032）

尼古丁（nicotine），又名煙堿，廣泛存在于茄科（Solanaceae）植物中。作為一種生物堿，尼古丁含量占煙草植物生物堿總量的95%，是煙草的重要成分，也是一種環境有毒物質。尼古丁易溶于醇、氯仿及石油醚等有機溶劑，是具有堿性的二元堿。根據N－甲基四氫吡咯在吡啶環上位置的不同，尼古丁可分為3種立體異構體：α－煙堿、β－煙堿和γ－煙堿，其中β－煙堿是尼古丁的主要存在形式。

一些微生物可以通過不同的代謝途徑（如吡啶途徑、吡咯途徑、脫甲基途徑等）利用尼古丁，具有研究和應用價值。近年來，利用微生物降解尼古丁已成為國內外研究的熱點。作者在此對尼古丁的危害及污染來源、微生物降解途徑等進行綜述。

1 尼古丁的危害及污染來源

1.1 尼古丁的危害

尼古丁不僅對人類有致毒、致癌等副作用，而且影響土壤生態結構，污染地下水，對土壤和環境造成嚴重污染，擾亂生態平衡。1994年，尼古丁被美國環保局正式列入有毒物質釋放目錄（Toxics Release Inventory）［1］。大量尼古丁可以抑制中樞神經系統，造成呼吸停止，心臟麻痹。尼古丁一旦進入人體細胞，就會變為一種神經毒素，使人產生興奮感，長期作用會導致依賴性，是吸煙成癮的主要作用物質；還可以轉化成多種具有高生物活性的物質（如NNN、NNK、cotinine、TSNA等），顯著提高癌癥（如肺癌等）的并發率［2］。

尼古丁在細胞水平上的影響還有：抑制細胞增殖和凋亡，造成姐妹染色單體交換和畸變，導致心臟休克蛋白表達加強［3］。流行病學研究表明，在妊娠期內，尼古丁的暴露可以顯著提高“嬰兒猝死綜合癥”（sudden infant death syndrome，SIDS）的發病風險［4］。尼古丁暴露可以對胎兒的生長發育產生嚴重影響，包括直接的致畸效應以及出生后表現出來的“印記”效應（妊娠期內，在胎兒器官和系統發育的敏感期內，某些發生在胎兒生長環境中的改變可能會對胎兒留下永久性的“印記”，在其出生后會影響內分泌系統、代謝系統、心腦血管等的正常發育）［5］。

1.2 尼古丁污染的來源

自然環境和人類生活環境中尼古丁的污染主要來源于煙草及其廢棄物、煙堿型農藥、尼古丁橡膠、尼古丁藥劑等［6］，尤其以煙草廢棄物污染最為嚴重。

我國是世界上最大的煙草生產國和消費國，煙草產量占世界總產量的35%，卷煙產量占世界總產量的32%，煙民數量占世界總量的20%，均位居世界第一，2007年，全行業利稅達3 880億元［7］。在巨大消費市場下，煙草行業逐步發展成為我國支柱產業之一，在國民經濟中占有很高的比例。然而，在煙草行業帶來巨大經濟效益的同時，由于煙草大規模廣泛種植、大量煙草制品的后期加工以及含尼古丁廢棄物的不合理排放，給自然環境和人類健康帶來巨大隱患。據統計，我國每年煙葉總產量約450萬～500萬t，其中約90萬～150萬t煙草制品下腳料被廢棄。這些煙草廢棄物中尼古丁平均含量高達18g·（kg干重）－1，是歐盟規定有毒有害煙草廢棄物中尼古丁含量控制標準的36倍［8］。由于尼古丁具有極好的水溶性，在自然環境中不易分解，所以很容易造成水體的污染，甚至造成地下水污染，對自然環境和人類健康帶來巨大威脅。因此，尼古丁污染處理受到研究人員的高度重視，微生物降解尼古丁也成為研究的熱點。

2 尼古丁的降解

尼古丁含量是影響卷煙制品品質的重要因素，含量過高會導致煙氣的刺激性強、卷煙吸味差、安全性差。目前，在煙草生產期間和后期加工過程中嚴格控制尼古丁的含量是減輕尼古丁污染的主要途徑，其方法主要有物理化學法和微生物降解法。

物理化學法成本較高、副產物多，影響煙草其它組分。如袁淑霞等［9］研究發現，添加HNO3改性活性炭可吸附煙氣中的尼古丁；王怡紅等［10］研究發現，NaCl等無機鹽對卷煙中的尼古丁具有去除效果；高興齋等［11］用氣浮加過濾，在調節池加以射流曝氣，對卷煙廠廢水進行處理，污染物去除率高達85%～95%，達到了廢水排放標準。

微生物降解法選擇性高、副產物少、高效、經濟且易操作，微生物資源豐富，代謝具有多樣性，所以得到了越來越多的關注。

3 尼古丁降解微生物

早在1927年，Batham［12］在土壤中加入尼古丁后發現硝酸鹽的含量有所增加，他認為這是土壤微生物作用的結果，這是最早的關于尼古丁降解菌的報道。此后，越來越多的尼古丁降解菌被發現，包括細菌、放線菌及真菌。迄今為止，已發現的可降解尼古丁的微生物主要有：細菌中的假單胞菌屬（如Pseudomonas putida S16［13］、Pseudomonas putida ZUTSKD［14］）、節桿菌屬（如Arthrobacter oxidans［15］）、纖維單胞菌屬［16］（如Cellulomonas sp.）、蒼白桿菌屬［17］（如Ochrobactrum intermedium）等；放線菌中的Streptomyces platense、Streptomyces griseus等；真菌中的Cunninghamella echinulata、Aspergillus oryzae［18］等。已發現的尼古丁降解菌中，大部分菌株可以以尼古丁為唯一碳源、氮源和能源生長。

假單胞菌是應用最廣泛的一類尼古丁降解微生物。最早關于降解尼古丁假單胞菌的報道是Wada等［19］在土壤中分離得到的尼古丁降解菌Pseudomonas sp.No.41，并開始對該菌株進行代謝途徑的研究。隨 后，Pseudomonas convexa Pc1［20］、Pseudomonas putida S16［13］、Pseudomonas sp.HF－1［8］、Pseudomonas putida ZUTSKD［14］、Pseudomonas sp.Nic22［21］、Pseudomonas putida ZB－16A［22］、Pseudomonas sp.HZN6［23］、Pseudomonas sp.CS3［24］等假單胞菌屬尼古丁降解菌陸續被報道。在這些假單胞菌中，耐受尼古丁能力最強的是P.putida ZB－16A和P.putida S16，可耐受尼古丁濃度高達6g·L－1，其次是P.putida ZUTSKD，可耐受尼古丁濃度為5.8g·L－1，其它菌株耐受尼古丁濃度一般在4g·L－1左右。P.putida S16降解能力最強，13h即可將4g·L－1的尼古丁完全降解。大部分假單胞菌降解尼古丁的最適溫度為30℃、最適pH值為7.0。隨著研究的深入，越來越多的可降解尼古丁的假單胞菌被發現，大部分屬于Pseudomonas putida，同時也有一些新發現的菌種，如Pseudomonas stutzeri ZCJ［25］，該菌株降解尼古丁的最適溫度為37℃、最適pH值為7.5、耐受尼古丁濃度達4.5g·L－1，在培養過程中，培養液會有顏色的變化。

4 微生物降解尼古丁的代謝途徑

關于微生物降解尼古丁的代謝途徑目前還處于研究階段。已報道并經證實的途徑主要有3種：廣泛存在于假單胞菌屬（Pseudomonas）和刺孢小克汗霉菌屬（Cunninghamella echinulata）的 吡 咯 途 徑（pyrrolidine pathway）、廣泛存在于節桿菌屬（Arthrobacter）的吡啶途徑（pyridine pathway）、廣泛存在于煙草植物及真菌（Pellicularia filamentosa）中的脫甲基途徑（Me pathway）［22，26－27］。

4.1 吡咯途徑（圖1）

吡咯途徑從尼古丁的吡咯烷脫氫開始，生成N－甲基麥思明（N－methymyosmine），接著水化成假氧化尼古丁（pseudooxynicotine），脫掉甲胺生成3－琥珀酰吡啶（3－succinoylpyridine，SP），SP通過羥基化生成6－羥基－3－琥珀酰吡啶（6－hydroxy－3－succinoylpyridine，HSP），進而生成2，5－二羥基吡啶（2，5－dihydroxy－pyridine，DHP），最后吡啶環打開，完成吡咯途徑的代謝。

4.2 吡啶途徑（圖2）

吡啶途徑從尼古丁在尼古丁脫氫酶（NDH）作用下吡啶環第6位羥基化生成6－羥基尼古丁（6－hydroxynicotine）開始，隨后在6－羥基尼古丁氧化酶（6－HNO）催化作用下生成6－羥基－N－甲基麥思明（6－hydroxy－N－methylmyosmine），6－羥基－N－甲基麥思明在酶6－HLNO或6－HDNO的催化作用下生成［6－羥基吡啶基－（3）］－甲胺丙基酮［N－methylaminopropyl－（6－hydroxypyridyl－3）－ketone］，而后在酮脫氫酶（KDH）催化作用下生成［2，6－二羥基吡啶基－（3）］－甲胺丙基酮［N－methylaminopropyl－（2，6－dihydroxypyridyl－3）－ketone］，隨后經2，6－二羥基假氧化尼古丁水解酶（DHPONH）的催化生成2，6－二羥基吡啶（2，6－dihydroxypyridine）和γ－甲胺基丁酸（γ－N－methylaminobutyrate），最后γ－甲胺基丁酸經N－甲胺基丁酸氧化酶（MABO）的催化生成γ－胺基丁酸（γ－aminobutyrate），2，6－二羥基吡啶經2，6－二羥基吡啶－3－羥化酶（2，6－DHPH）的催化生成2，3，6－三羥基吡啶（2，3，6－trihydroxy－pyridine）。值得注意的是，尼古丁代謝吡啶途徑中培養液經常會出現顏色的變化，可能是由于在代謝過程中，一些小分子的代謝中間產物聚合成藍色聚合物——尼古丁藍（nicotine blue）所致。

圖1 尼古丁代謝的吡咯途徑Fig.1 Pyrrolidine pathway of nicotine metabolism

圖2 尼古丁代謝的吡啶途徑Fig.2 Pyridine pathway of nicotine metabolism

4.3 脫甲基途徑

脫甲基途徑始于尼古丁吡咯烷的脫甲基化，先生成去甲基尼古丁（nornicotine），然后沿著去甲基尼古丁的代謝途徑進一步代謝降解。

4.4 其它途徑

隨著尼古丁代謝途徑研究的不斷深入，一些新的尼古丁代謝途徑及代謝產物被發現。利用GC－MS分析Pseudomonas sp.ZUTSKD對尼古丁的降解產物，檢測到有可天寧、2，3′－二吡啶、3－（2，3，4－三氫－5－吡咯基）－吡啶和3－羧基－吡啶的生成，推斷3－（2，3，4－三氫－5－吡咯基）－吡啶是由尼古丁經可天寧脫－CH3生成，這可能是尼古丁在Pseudomonas sp.ZUTSKD中降解代謝的初始步驟，不同于已知的微生物代謝尼古丁的途徑。因此，推測Pseudomonas sp.ZUTSKD可能有著全新的尼古丁代謝途徑［28］。

在對Pseudomonas sp.HF－1和Pseudomonas sp.Nic22尼古丁代謝中間產物進行分析時發現了可鐵寧、去甲基尼古丁、麥思明等，在Pseudomonas sp.HF－1代謝尼古丁產物中還發現了尼古提林，通過HPLC、GC－MS、NMR和FTIR分析Pseudomonas plecoglossicida TND35降解尼古丁產物，發現了3種新的中間產物，這些均表明菌株中可能存在著其它的尼古丁代謝途徑［22，29］。

5 結語

尼古丁不僅嚴重威脅人體健康，而且破壞土壤生態結構，擾亂生態平衡。微生物可以以尼古丁作為唯一的碳源、氮源和能源進行生長繁殖，最終將尼古丁通過不同的代謝途徑降解成無害的物質。細菌中的假單胞菌屬是降解尼古丁最廣泛的微生物，其降解能力和耐受能力較強，具有較高的研究和實際應用價值。在未來的研究中，可以從酶學和分子生物學水平研究微生物代謝尼古丁的機理，找到關鍵酶及其基因，利用基因工程手段增強微生物對尼古丁的降解能力。

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