真菌性角膜炎的實驗室快速診斷方法分析

趙志偉+張?zhí)N莉

【摘要】 目的：探討真菌性角膜炎快速而有效的臨床實驗室診斷方法。方法：對2012年6-12月53例臨床疑似真菌性角膜炎患者送檢的角膜刮片標本，同時進行墨汁-KOH濕片法鏡檢、熒光染色鏡檢和真菌培養(yǎng)。以真菌培養(yǎng)為診斷金標準，對墨汁-KOH濕片法與熒光染色法進行方法學比較。結果：32例真菌培養(yǎng)陽性標本，墨汁-KOH濕片法20例陽性，陽性率為62.5%，熒光染色28例陽性，陽性率為87.5%，兩者陽性率比較差異有統(tǒng)計學意義（字2=6.125，P=0.025）；兩種涂片鏡檢共為陽性的20例，共為陰性的4例。結論：熒光染色法鏡檢可以提高真菌性角膜炎的陽性診斷率，是真菌性角膜炎快速、簡單、有效的臨床實驗室診斷方法。

【關鍵詞】 真菌性角膜炎； 墨汁-KOH濕片法； 熒光染色法

Analysis of Laboratory Rapid Diagnostic Method of Fungal Keratitis/ZHAO Zhi-wei，ZHANG Yun-li.//Medical Innovation of China，2014，11（01）：075-077

【Abstract】 Objective：To study the rapid and effective clinical laboratory diagnostic methods of fungal keratitis.Method：Specimens of 53 clinical suspected patients with fungal keratitis from June 2012 to December 2012 were selected， for the ink - KOH wet method microscopy， fluorescence staining microscopy and fungal culture at the same time. Fungus culture as the diagnostic gold standard， the results of ink - KOH wet method microscopy and fluorescent staining microscopy were compared.Result：In 32 cases of positive specimens of fungal culture， 20 cases were positive in ink - KOH wet microscopy， the positive rate was 62.5%， 28 cases were positive in fluorescent staining microscopy， the positive rate was 87.5%， Two positive rate comparisons difference was statistically significant （字2=6.125， P=6.125）. There were 20 cases both kinds of smear microscopy were positive， 4 cases were both negative.Conclusion：The fluorescence staining microscopy can improve the positive diagnosis rate of fungal keratitis， it is a kind of rapid， simple and effective method of clinical laboratory diagnosis.

【Key words】 Fungal keratitis； Ink-KOH wet method； Fluorescent staining method

First-authors address：The Central Hospital of Jinzhou City，Jinzhou 121000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.01.036

真菌性角膜炎是由鐮刀菌、曲霉菌、頭芽孢菌和酵母菌等致病性真菌引起的感染性眼病，常伴有角膜潰瘍及視力下降，由于早期不易診斷，常造成誤診、漏診，導致患者因治療不當而失明[1-3]。因此，采用快速而有效的實驗室方法來確定病因，對指導臨床正確與及時的治療至關重要。錦州地處遼寧西部，氣候干燥，玉米是當?shù)刂饕r作物，夏秋農忙季節(jié)由于農作物枝葉刮傷造成的真菌性角膜炎比較常見。現(xiàn)將2012年6-12月眼科送檢的53例疑似真菌性角膜炎患者標本使用墨汁-KOH濕片法鏡檢、熒光染色法鏡檢和真菌培養(yǎng)結果進行統(tǒng)計和分析，具體情況報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 53份標本來自2012年6-12月本院眼科就診的經(jīng)臨床診斷為疑似真菌感染角膜炎的患者。

1.2 標本采集 患者眼部布比可因（貝諾喜）表面麻醉后，在裂隙燈下先用無菌棉簽擦去表面壞死組織，再用無菌手術刀片刮取角膜潰瘍基底部組織，置于清潔載玻片上，加一滴無菌生理鹽水后在其上再加蓋一張載玻片，另取一份標本置無菌管中，標本采集后立即送檢。

1.3 儀器和試劑 墨汁-KOH消化液為實驗室自行配制，墨汁和10%KOH按1：9比例混合。真菌熒光染色試劑為美國Polysciences公司的Fungi-Fluor真菌熒光染色檢測試劑盒。真菌培養(yǎng)基為沙保羅斜面，為實驗室自行配制。普通光學顯微鏡和熒光顯微鏡為日本產奧林巴斯。

1.4 檢查方法

1.4.1 墨汁-KOH濕片法鏡檢 將夾有角膜組織的一張載玻片滴加一滴1：9的墨汁-KOH（10%）混合液，蓋上蓋玻片壓緊后普通光學顯微鏡鏡檢。

1.4.2 熒光染色法鏡檢 夾有角膜組織的另一張載玻片，直接滴加熒光染色液，加蓋片2 min后熒光顯微鏡鏡檢。

1.4.3 真菌培養(yǎng) 生物安全柜內將無菌管內角膜組織接種于沙氏培養(yǎng)基斜面，25 ℃培養(yǎng)2周。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計數(shù)資料采用 字2檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩種檢查方法染色鏡檢效果 墨汁-KOH濕片法染色后，在光學顯微鏡低倍視野下可以觀察到角膜壞死組織已經(jīng)溶解，真菌菌絲及孢子清晰顯現(xiàn)。高倍鏡下真菌菌絲及孢子呈折光反應，與墨汁形成的黑色背景形成反差（圖1）。經(jīng)熒光染色后，在熒光顯微鏡下可以觀察到真菌菌絲及孢子呈現(xiàn)綠色，背景為暗紅色（圖2）。

圖1 墨汁-KOH濕片法（×400）

圖2 熒光染色法（×400）

注：真菌菌絲及孢子呈折光反應，與墨汁形成的黑色背景形成反差（圖1）；經(jīng)熒光染色后，在熒光顯微鏡下可以觀察到真菌菌絲及孢子呈現(xiàn)綠色，背景為暗紅色（圖2）

2.2 診斷結果比較 53例疑似真菌感染角膜炎患者送檢標本中，32例真菌培養(yǎng)陽性，陽性率為60.4%。以真菌培養(yǎng)為診斷金標準，分析墨汁-KOH濕片法和熒光染色法結果；真菌培養(yǎng)陽性標本中，墨汁-KOH濕片法20例陽性，陽性率為62.5%；熒光染色法陽性28例，陽性率為87.5%；兩種涂片鏡檢方法結果差異具有統(tǒng)計學意義（字2=6.125，P=0.025）。兩者染色均為陽性的20例，均為陰性的4例，見表1。

表1 兩種涂片鏡檢方法結果 例

墨汁-KOH 熒光白染色法 合計

﹢ ﹣

﹢ 20 0 20

﹣ 8 4 12

合計 28 4 32

3 討論

真菌性角膜炎通常是由角膜外傷引起的比較嚴重的致盲性眼病，病因較多，尤以植物性外傷感染為主[4-5]。此類眼病常可引起患者角膜的潰瘍甚至失明，因此真菌性角膜炎早期的快速而有效的診斷對臨床治療非常重要。盡管典型的臨床癥狀和外傷史有助于診斷，但準確可靠的診斷依然取決于實驗室技術[6]。

傳統(tǒng)的實驗室檢查方法，主要以KOH濕片法和真菌培養(yǎng)為主。本室采用的墨汁-KOH濕片法鏡檢，雖然具有簡單、快速、鏡下對比度強的優(yōu)點，但其陽性率較低，且有一定的假陽性存在，從而容易造成漏診和誤診[7]。真菌培養(yǎng)雖準確可靠，但因培養(yǎng)時間過長（1～2周），故不能做出快速診斷從而影響患者的及時治療[8]。

隨著科學技術發(fā)展，一些新的診斷儀器和方法在臨床中不斷得到應用，并在應用中日臻完善。共焦掃描顯微鏡是一種新型、無創(chuàng)性角膜影像學檢查儀器，它可在活體上對角膜從四維（三維空間和時間）水平進行掃描成像，提供高清晰度的角膜各層結構圖像，因而可以從細胞水平對活體角膜的病理生理進行直接觀察研究，具有檢出率高、快速、安全無創(chuàng)以及可重復等優(yōu)點，但其對角膜潰瘍面積較小或位置較淺的病例易漏診，且費用較貴[9]。聚合酶鏈反應（PCR）是引物介導的生物體外特定基因的連續(xù)擴增方法，這一技術可以在實驗室內完成目的DNA或RNA合成和擴增，如應用臨床可以實現(xiàn)病原的早期診斷，但因此方法實驗室要求高，試劑價格昂貴而不易推廣[10]。

現(xiàn)今，在大多數(shù)醫(yī)院中角膜刮片染色鏡檢仍是臨床應用最為廣泛的實驗室診斷方法，染色鏡檢具有取材方便、檢測快速及對實驗設備要求簡單等優(yōu)點。這些染色方法包括革蘭染色、姬姆薩染色、熒光染色以及糖原染色等[11]。

在本研究中，53例疑似真菌感染角膜炎患者送檢標本中，32例真菌培養(yǎng)陽性，陽性率為60.4%。此結果，部分原因可能是患者在就診檢查前已經(jīng)使用抗真菌藥物，另一方面，臨床癥狀和外傷史不是真菌性角膜炎確診的絕對依據(jù)，如僅憑臨床癥狀和外傷史診斷，有一定的誤診率。臨床32例真菌培養(yǎng)陽性標本，熒光染色法陽性28例，陽性率為87.5%，墨汁-KOH濕片法20例陽性，陽性率為62.5%，兩者差異具統(tǒng)計學意義（字2=6.125，P=0.025）。這一結果表明，檢測真菌性角膜炎熒光染色法的陽性率明顯高于墨汁-KOH濕片法。且熒光染色在熒光顯微鏡下對比明顯容易檢出，熒光染色法相對于其他新的檢測方法來說費用相對不高，又可以做到對真菌性角膜炎的簡單、快速、準確的早期診斷。因此，熒光染色法可以在臨床實驗室中取代墨汁-KOH濕片法作為真菌性角膜炎早期診斷的首選方法。

參考文獻

[1]姚寶珠，陳季生.65例真菌性角膜潰瘍臨床治療分析[J].中外醫(yī)學研究，2011，9（19）：105-106.

[2]高新蕊，蘇晶，崔紅平.真菌性角膜炎發(fā)病機制的研究進展[J].中國醫(yī)療前沿，2007，2（21）：38-40.

[3]劉立春.真菌性角膜炎的實驗室診斷及藥物敏感試驗分析[J].中國現(xiàn)代藥物應用，2008，2（20）：75.

[4]曾慶延，牛曉光，吳尚操.長江中下游地區(qū)真菌性角膜炎發(fā)病特征及轉歸分析[J].國際眼科雜志，2010，10（10）：1947-1949.

[5]馬靈軍，張麗娟，賀丹，等.吉林省真菌性角膜炎病原學分析[J].中國實驗診斷學，2009，13（1）：106-107.

[6]張偉宏，王麗婭，韓雷，等.真菌性角膜炎的早期診斷技術[J].醫(yī)學與臨床（臨床決策論壇版），2009，30（6）：65-66.

[7]魏文利，張蕊石，周向京.聯(lián)合試驗在真菌性角膜炎診斷中的應用[J].實用醫(yī)學雜志，2011，27（1）：113-115.

[8]張進，韓敏杰，駱駿.真菌性角膜炎的實驗室診斷[J].長江大學學報（自然科學版），2010，7（1）：270-273.

[9]王學勇，王緒梅.共聚焦顯微鏡在真菌性角膜炎中的應用[J].國際眼科雜志，2011，11（2）：311-312.

[10]楊連娟，徐紅，溫海.真菌性角膜炎的實驗室診斷[J].中國真菌學雜志，2007，2（2）：122-125.

[11]李淼，張林.真菌性角膜炎的研究進展[J].國際眼科雜志，2008，8（2）：384-387.

（收稿日期：2013-06-28） （本文編輯：蔡元元）

1.4.2 熒光染色法鏡檢 夾有角膜組織的另一張載玻片，直接滴加熒光染色液，加蓋片2 min后熒光顯微鏡鏡檢。

1.4.3 真菌培養(yǎng) 生物安全柜內將無菌管內角膜組織接種于沙氏培養(yǎng)基斜面，25 ℃培養(yǎng)2周。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計數(shù)資料采用 字2檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩種檢查方法染色鏡檢效果 墨汁-KOH濕片法染色后，在光學顯微鏡低倍視野下可以觀察到角膜壞死組織已經(jīng)溶解，真菌菌絲及孢子清晰顯現(xiàn)。高倍鏡下真菌菌絲及孢子呈折光反應，與墨汁形成的黑色背景形成反差（圖1）。經(jīng)熒光染色后，在熒光顯微鏡下可以觀察到真菌菌絲及孢子呈現(xiàn)綠色，背景為暗紅色（圖2）。

圖1 墨汁-KOH濕片法（×400）

圖2 熒光染色法（×400）

注：真菌菌絲及孢子呈折光反應，與墨汁形成的黑色背景形成反差（圖1）；經(jīng)熒光染色后，在熒光顯微鏡下可以觀察到真菌菌絲及孢子呈現(xiàn)綠色，背景為暗紅色（圖2）

2.2 診斷結果比較 53例疑似真菌感染角膜炎患者送檢標本中，32例真菌培養(yǎng)陽性，陽性率為60.4%。以真菌培養(yǎng)為診斷金標準，分析墨汁-KOH濕片法和熒光染色法結果；真菌培養(yǎng)陽性標本中，墨汁-KOH濕片法20例陽性，陽性率為62.5%；熒光染色法陽性28例，陽性率為87.5%；兩種涂片鏡檢方法結果差異具有統(tǒng)計學意義（字2=6.125，P=0.025）。兩者染色均為陽性的20例，均為陰性的4例，見表1。

表1 兩種涂片鏡檢方法結果 例

墨汁-KOH 熒光白染色法 合計

﹢ ﹣

﹢ 20 0 20

﹣ 8 4 12

合計 28 4 32

3 討論

真菌性角膜炎通常是由角膜外傷引起的比較嚴重的致盲性眼病，病因較多，尤以植物性外傷感染為主[4-5]。此類眼病常可引起患者角膜的潰瘍甚至失明，因此真菌性角膜炎早期的快速而有效的診斷對臨床治療非常重要。盡管典型的臨床癥狀和外傷史有助于診斷，但準確可靠的診斷依然取決于實驗室技術[6]。

傳統(tǒng)的實驗室檢查方法，主要以KOH濕片法和真菌培養(yǎng)為主。本室采用的墨汁-KOH濕片法鏡檢，雖然具有簡單、快速、鏡下對比度強的優(yōu)點，但其陽性率較低，且有一定的假陽性存在，從而容易造成漏診和誤診[7]。真菌培養(yǎng)雖準確可靠，但因培養(yǎng)時間過長（1～2周），故不能做出快速診斷從而影響患者的及時治療[8]。

隨著科學技術發(fā)展，一些新的診斷儀器和方法在臨床中不斷得到應用，并在應用中日臻完善。共焦掃描顯微鏡是一種新型、無創(chuàng)性角膜影像學檢查儀器，它可在活體上對角膜從四維（三維空間和時間）水平進行掃描成像，提供高清晰度的角膜各層結構圖像，因而可以從細胞水平對活體角膜的病理生理進行直接觀察研究，具有檢出率高、快速、安全無創(chuàng)以及可重復等優(yōu)點，但其對角膜潰瘍面積較小或位置較淺的病例易漏診，且費用較貴[9]。聚合酶鏈反應（PCR）是引物介導的生物體外特定基因的連續(xù)擴增方法，這一技術可以在實驗室內完成目的DNA或RNA合成和擴增，如應用臨床可以實現(xiàn)病原的早期診斷，但因此方法實驗室要求高，試劑價格昂貴而不易推廣[10]。

現(xiàn)今，在大多數(shù)醫(yī)院中角膜刮片染色鏡檢仍是臨床應用最為廣泛的實驗室診斷方法，染色鏡檢具有取材方便、檢測快速及對實驗設備要求簡單等優(yōu)點。這些染色方法包括革蘭染色、姬姆薩染色、熒光染色以及糖原染色等[11]。

在本研究中，53例疑似真菌感染角膜炎患者送檢標本中，32例真菌培養(yǎng)陽性，陽性率為60.4%。此結果，部分原因可能是患者在就診檢查前已經(jīng)使用抗真菌藥物，另一方面，臨床癥狀和外傷史不是真菌性角膜炎確診的絕對依據(jù)，如僅憑臨床癥狀和外傷史診斷，有一定的誤診率。臨床32例真菌培養(yǎng)陽性標本，熒光染色法陽性28例，陽性率為87.5%，墨汁-KOH濕片法20例陽性，陽性率為62.5%，兩者差異具統(tǒng)計學意義（字2=6.125，P=0.025）。這一結果表明，檢測真菌性角膜炎熒光染色法的陽性率明顯高于墨汁-KOH濕片法。且熒光染色在熒光顯微鏡下對比明顯容易檢出，熒光染色法相對于其他新的檢測方法來說費用相對不高，又可以做到對真菌性角膜炎的簡單、快速、準確的早期診斷。因此，熒光染色法可以在臨床實驗室中取代墨汁-KOH濕片法作為真菌性角膜炎早期診斷的首選方法。

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[9]王學勇，王緒梅.共聚焦顯微鏡在真菌性角膜炎中的應用[J].國際眼科雜志，2011，11（2）：311-312.

[10]楊連娟，徐紅，溫海.真菌性角膜炎的實驗室診斷[J].中國真菌學雜志，2007，2（2）：122-125.

[11]李淼，張林.真菌性角膜炎的研究進展[J].國際眼科雜志，2008，8（2）：384-387.

（收稿日期：2013-06-28） （本文編輯：蔡元元）

1.4.2 熒光染色法鏡檢 夾有角膜組織的另一張載玻片，直接滴加熒光染色液，加蓋片2 min后熒光顯微鏡鏡檢。

1.4.3 真菌培養(yǎng) 生物安全柜內將無菌管內角膜組織接種于沙氏培養(yǎng)基斜面，25 ℃培養(yǎng)2周。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計數(shù)資料采用 字2檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩種檢查方法染色鏡檢效果 墨汁-KOH濕片法染色后，在光學顯微鏡低倍視野下可以觀察到角膜壞死組織已經(jīng)溶解，真菌菌絲及孢子清晰顯現(xiàn)。高倍鏡下真菌菌絲及孢子呈折光反應，與墨汁形成的黑色背景形成反差（圖1）。經(jīng)熒光染色后，在熒光顯微鏡下可以觀察到真菌菌絲及孢子呈現(xiàn)綠色，背景為暗紅色（圖2）。

圖1 墨汁-KOH濕片法（×400）

圖2 熒光染色法（×400）

注：真菌菌絲及孢子呈折光反應，與墨汁形成的黑色背景形成反差（圖1）；經(jīng)熒光染色后，在熒光顯微鏡下可以觀察到真菌菌絲及孢子呈現(xiàn)綠色，背景為暗紅色（圖2）

2.2 診斷結果比較 53例疑似真菌感染角膜炎患者送檢標本中，32例真菌培養(yǎng)陽性，陽性率為60.4%。以真菌培養(yǎng)為診斷金標準，分析墨汁-KOH濕片法和熒光染色法結果；真菌培養(yǎng)陽性標本中，墨汁-KOH濕片法20例陽性，陽性率為62.5%；熒光染色法陽性28例，陽性率為87.5%；兩種涂片鏡檢方法結果差異具有統(tǒng)計學意義（字2=6.125，P=0.025）。兩者染色均為陽性的20例，均為陰性的4例，見表1。

表1 兩種涂片鏡檢方法結果 例

墨汁-KOH 熒光白染色法 合計

﹢ ﹣

﹢ 20 0 20

﹣ 8 4 12

合計 28 4 32

3 討論

真菌性角膜炎通常是由角膜外傷引起的比較嚴重的致盲性眼病，病因較多，尤以植物性外傷感染為主[4-5]。此類眼病常可引起患者角膜的潰瘍甚至失明，因此真菌性角膜炎早期的快速而有效的診斷對臨床治療非常重要。盡管典型的臨床癥狀和外傷史有助于診斷，但準確可靠的診斷依然取決于實驗室技術[6]。

傳統(tǒng)的實驗室檢查方法，主要以KOH濕片法和真菌培養(yǎng)為主。本室采用的墨汁-KOH濕片法鏡檢，雖然具有簡單、快速、鏡下對比度強的優(yōu)點，但其陽性率較低，且有一定的假陽性存在，從而容易造成漏診和誤診[7]。真菌培養(yǎng)雖準確可靠，但因培養(yǎng)時間過長（1～2周），故不能做出快速診斷從而影響患者的及時治療[8]。

隨著科學技術發(fā)展，一些新的診斷儀器和方法在臨床中不斷得到應用，并在應用中日臻完善。共焦掃描顯微鏡是一種新型、無創(chuàng)性角膜影像學檢查儀器，它可在活體上對角膜從四維（三維空間和時間）水平進行掃描成像，提供高清晰度的角膜各層結構圖像，因而可以從細胞水平對活體角膜的病理生理進行直接觀察研究，具有檢出率高、快速、安全無創(chuàng)以及可重復等優(yōu)點，但其對角膜潰瘍面積較小或位置較淺的病例易漏診，且費用較貴[9]。聚合酶鏈反應（PCR）是引物介導的生物體外特定基因的連續(xù)擴增方法，這一技術可以在實驗室內完成目的DNA或RNA合成和擴增，如應用臨床可以實現(xiàn)病原的早期診斷，但因此方法實驗室要求高，試劑價格昂貴而不易推廣[10]。

現(xiàn)今，在大多數(shù)醫(yī)院中角膜刮片染色鏡檢仍是臨床應用最為廣泛的實驗室診斷方法，染色鏡檢具有取材方便、檢測快速及對實驗設備要求簡單等優(yōu)點。這些染色方法包括革蘭染色、姬姆薩染色、熒光染色以及糖原染色等[11]。

在本研究中，53例疑似真菌感染角膜炎患者送檢標本中，32例真菌培養(yǎng)陽性，陽性率為60.4%。此結果，部分原因可能是患者在就診檢查前已經(jīng)使用抗真菌藥物，另一方面，臨床癥狀和外傷史不是真菌性角膜炎確診的絕對依據(jù)，如僅憑臨床癥狀和外傷史診斷，有一定的誤診率。臨床32例真菌培養(yǎng)陽性標本，熒光染色法陽性28例，陽性率為87.5%，墨汁-KOH濕片法20例陽性，陽性率為62.5%，兩者差異具統(tǒng)計學意義（字2=6.125，P=0.025）。這一結果表明，檢測真菌性角膜炎熒光染色法的陽性率明顯高于墨汁-KOH濕片法。且熒光染色在熒光顯微鏡下對比明顯容易檢出，熒光染色法相對于其他新的檢測方法來說費用相對不高，又可以做到對真菌性角膜炎的簡單、快速、準確的早期診斷。因此，熒光染色法可以在臨床實驗室中取代墨汁-KOH濕片法作為真菌性角膜炎早期診斷的首選方法。

參考文獻

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（收稿日期：2013-06-28） （本文編輯：蔡元元）