苦參堿二元醇質體的制備及其質量評價

何冰倩， 李俊麗， 劉小平， 林如文

(武漢理工大學化工學院制藥工程系，湖北 武漢430070)

苦參堿(Matrine)是豆科植物苦參、苦豆子、山豆根等藥用植物的活性成分，于1958 年被首次分離和確認，屬四環喹嗪啶類化合物［1］，具有抗菌、抗炎、抗心律失常、抗腫瘤等重要作用。現代藥理研究表明，苦參堿對多種病原微生物、陰道滴蟲等有顯著抑制作用，故常用于治療婦科炎癥。由于婦科炎癥發病率高、發作反復、臨床表現多樣化、發作年齡段廣等特點，因此對婦科炎癥的治療刻不容緩［2］。目前，臨床治療主要以局部給藥為主，常用的有栓劑、軟膏、溶液等［3］。但由于存在皮膚角質層的屏障作用使得藥物難以透過皮膚發揮藥效，臨床療效差。所以促進藥物在給藥部位的滲透吸收成為研究熱點。

醇質體(Ethosomes)是一種由磷脂、高濃度低分子量的醇、水組成的具有脂質雙分子層結構的新型柔性脂質體，能有效地運送藥物通過角質層進入皮膚更深層甚至血液循環，憑借其高滲透率、高包封率、高變形性等顯著優點越來越受到青睞［4-5］。但醇質體中存在的高濃度乙醇的揮發性易引起穩定性問題，用乙醇和丙二醇的混合醇替換單一的乙醇來制備醇質體，即二元醇質體，與普通醇質體相比，具有良好的變形性、透皮性及穩定性，具有良好的應用前景［6-7］。

本實驗擬制備苦參堿二元醇質體，對其處方進行優化，并對其質量控制進行研究，以期為研發新型苦參堿制劑奠定實驗基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器 FA2004 電子分析天平(上海精密科學儀器有限公司);DF-101S 恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市英峪予華儀器廠);TGL16C 超速離心機(上海安亭科學儀器廠);LC-20AT 高效液相色譜儀(HPLC，日本島津);BI-200SM動態光散射儀(DLS，美國BROOKHAVEN);Tecnai G220 S-TWIM 透射電子顯微鏡(TEM，美國FEI);LS-3000 低溫光照儀(藥物制劑國家工程研究中心)。

1.2 材料 苦參堿 (江蘇天晟藥業有限公司，批號20130203，純度98%);苦參堿對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號110805-201302);卵磷脂、膽固醇等(均購于國藥集團化學試劑有限公司);其他試劑均為分析純，流動相所用乙腈、乙醇(色譜純，國藥集團化學試劑公司)。

2 方法與結果

2.1 醇質體的制備

2.1.1 苦參堿二元醇質體的制備 采用醇注入法制備［8］。稱取處方量卵磷脂溶于處方量乙醇與丙二醇混合溶液中，同時稱取處方量苦參堿溶于處方量醋酸鹽緩沖液(pH =4.5)。(37 ±1)℃恒溫密封持續攪拌條件下，將醇相緩慢注入到水相中，注射完畢后，繼續恒溫攪拌30 min，過0.22 μm 濾膜濾過即得醇質體溶液。

2.1.2 空白醇質體的制備 稱取處方量卵磷脂溶于處方量乙醇與丙二醇混合溶液中，量取處方量醋酸鹽緩沖液，其他操作同上。

2.2 苦參堿測定方法的確定

2.2.1 色譜條件 YMC-Pack NH2色譜柱 (4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相乙腈-乙醇(9 ∶1，V/V);體積流量0.8 mL/min;檢測波長215 nm;柱溫室溫;進樣量20 μL。

2.2.2 標準曲線的確定 精密稱取10 mg 苦參堿對照品，置于100 mL 量瓶中，加流動相溶解，稀釋至刻度并搖勻，得100 μg/mL 的苦參堿溶液。精密量取上述溶液1 mL 置于100 mL 量瓶中，另取1、2、4、6、8 mL 分別置于10 mL 量瓶中，加流動相稀釋至刻度并搖勻，分別得苦參堿質量濃度為1、10、20、40、60、80、100 μg/mL 的溶液。按“2.2.1”項下條件進行檢測，以峰面積(A)對質量濃度(C)進行線性回歸，得回歸方程A =32 046C +22 081，r2=0.999 1，結果表明苦參堿在1 ～100 μg/mL 范圍內峰面積與質量濃度呈良好的線性關系。

2.2.3 方法學考察

2.2.3.1 精密度試驗 精密吸取低、中、高質量濃度苦參堿對照品溶液，分別按“2.2.1”項下條件進行檢測，重復進樣5 次，以峰面積計算，RSD 分別為0.59%、0.76%、0.57%，平均RSD=0.64%。

2.2.3.2 穩定性試驗 精密吸取低、中、高質量濃度苦參堿對照品溶液，分別在0、24、48 h 按“2.2.1”項下條件進行檢測，以峰面積計算，RSD 分別為0.83%、0.75%、0.76%，平均RSD=0.78%，表明標準溶液在48 h 內穩定性良好。

2.2.3.3 回收率試驗 量取3 份空白醇質體溶液10 mL，分別加入苦參堿對照品100、200、300 mg，使苦參堿完全溶解。按“2.2.1”項下條件進行檢測，以峰面積計算，求得平均回收率為96.88% (n=9);RSD 為0.47%。

2.2.3.4 供試品溶液專屬性 供試品溶液的制備:精密吸取苦參堿二元醇質體溶液0.1 mL，置于10 mL 量瓶中，加適量甲醇破乳，加流動相定容搖勻后，即得供試品溶液。空白對照溶液:精密吸取空白醇質體溶液0.1 mL，置于10 mL量瓶中，加適量甲醇破乳，并用流動相定容搖勻后，即得空白對照溶液。

專屬性試驗 精密吸取苦參堿對照品溶液、供試品溶液和空白對照液，按“2.2.1”項下條件進行測定，色譜圖見圖1。表明苦參堿對照品及所制備的苦參堿二元醇質體在該色譜條件下4 min 左右出峰，峰形穩定，且空白醇質體對苦參堿的測定無干擾。

圖1 3 種溶液的HPLC 圖譜

2.3 包封率的測定 量取苦參堿二元醇質體0.5 mL 置于超濾離心管中，置于超速離心機中以12 000 r/min 離心20 min，離心完成后吸取下層清液0.1 mL 于10 mL 量瓶中，用流動相定容搖勻后，按“2.2.1”項下條件進行測定，計算游離藥物質量m游;精密吸取0.1 mL 醇質體，甲醇破乳，0.22 μm 微孔濾膜濾過后進行測定，計算醇質體中藥物總量m總，包封率(%) = (m總-m游)/m總×100%。

2.4 滲漏率的測定 測定苦參堿二元醇質體制備完成首日的包封率后，在一定條件下保存一段時間后再測定其包封率，滲漏率(%) = (首日包封率-定期測定包封率)/首日包封率×100%。

2.5 正交試驗優化苦參堿二元醇質體處方 通過考察單因素試驗的結果，選擇對苦參堿二元醇質體包封率影響較大的乙醇與丙二醇醇溶液總體積與醋酸鹽緩沖液的體積比(A)、苦參堿與卵磷脂質量比(B)、乙醇與丙二醇的體積比(C)作為考察因素，每個因素取3 個水平，選L9(34)正交表進行處方正交試驗設計，以包封率為篩選指標，確定苦參堿二元醇質體的最佳制備工藝。考察因素與水平見表1，實驗設計及結果見表2。由表2 可知，可知對包封率的影響因素大小為B ＞A ＞C，A3B3C2為較優處方。按照最佳處方制備3 組苦參堿二元醇質體，可得包封率分別為65.38%、68.01%、67.56%，平均包封率為66.98%。

表1 L9(34)正交試驗因素水平

表2 正交試驗設計與結果(n=3)

2.6 苦參堿二元醇質體的質量控制研究

2.6.1 形態觀察 將苦參堿二元醇質體樣品用30%乙醇溶液稀釋10 倍，取一定量的稀釋液，固定于銅絲網格上，用透射電子顯微鏡觀察，可見醇質體為類球狀小囊泡，形態圓整。

圖2 苦參堿二元醇質體在透射電子顯微鏡下的形態

2.6.2 粒徑 取苦參堿二元醇質體適量，適當稀釋后用動態光散射儀測定其粒徑及分布，結果見圖3。結果顯示，較優方案制備的苦參堿二元醇質體平均粒徑為275.8 nm，聚合度為0.064，分布均勻。

圖3 苦參堿二元醇質體粒徑分布圖(Gd 為醇質體個數，Cd 為累積百分比)

2.7 初步穩定性試驗

2.7.1 滲漏率的測定 采用最佳制備工藝制備的苦參堿二元醇質體3 批測得首日包封率后，于冰箱4 ℃保存7 d 后依照“2.4”項下的方法測定其滲漏率，平均首日包封率為67.12%，7 d 后平均包封率為66.58%，滲漏率為0.81%。

2.7.2 光照對穩定性的影響 采用最佳制備工藝制備的苦參堿二元醇質體3 批測得首日包封率后，于低溫光照儀4 ℃、4 500 Lx 照度條件下保存14、30 d 后測其滲漏率。首日包封率為68.11%，14 d 后包封率為64.48%，滲漏率為5.33%;30 d 后包封率為59.48%，滲漏率為12.67%。分別對制備當天及光照條件下保存14 d 及30 d 后的醇質體進行形態觀察:制備當天的苦參堿二元醇質體為均勻同質的乳白色溶液，光照下有藍色乳光。在4 ℃、4 500 Lx 照度條件下保存14 d，仍為均勻同質的乳白色溶液，光照下有藍色乳光;30 d 后顏色不及剛制備時明亮，有少許沉淀，輕輕搖晃，可恢復原狀。

2.7.3 溫度對穩定性的影響 測定采用最佳制備工藝制備的苦參堿二元醇質體6 批的平均首日包封率，將其分為兩組分別置于低溫(4 ℃)及室溫(25 ℃)下避光保存30 d，兩組首日包封率分別為67.38%、67.12%，30 d 后包封率分別為65.33%、58.83%，滲漏率分別為2.58%、12.36%。分別對制備當天及30 d 后的醇質體進行形態觀察:剛制備完成的苦參堿二元醇質體為均勻同質的乳白色溶液，光照下有藍色乳光。在4 ℃條件下避光放置30 d 后，無明顯變化;在室溫(25 ℃)條件下密封避光放置30 d 后，有少許沉淀產生，無明顯顏色變化，輕輕搖晃后可恢復原狀。

3 討論

采用醇注入法制備的苦參堿二元醇質體為類球狀小囊泡，形態圓整，具有較高的包封率，平均粒徑為275.8 nm，聚合度為0.064，分布均勻。且實驗設備操作簡單，重現性好，安全性更佳。通過對苦參堿二元醇質體處方的正交篩選結果可知，丙二醇的適當加入可使醇質體包封率增加，可能的原因是丙二醇分子滲入到磷脂膜材中降低了醇質體雙分子層內的流動性，增加其親水性，使苦參堿藥物分子進入其中而使包封率增加。但當丙二醇的質量分數增大到一定程度時，磷脂膜柔性過大可以形成粒徑更小的醇質體使內水相減少，導致包封率降低［9］。另外，通過對醇質體的初步穩定性試驗，確定了其貯存條件及存放時間，對保證制劑的質量具有一定的實際意義。

醇質體具有磷脂膜結構，能夠很好地融合或者穿透皮膚細胞。其中含有的高體積分數乙醇在一定程度上起到了促滲作用，提高藥物療效，但其也具有較大揮發性，穩定性差，使藥物容易泄露，在一定程度上限制了其應用。而丙二醇黏度較大，不易揮發，刺激性小，可改善揮發性及對皮膚的刺激性，增加醇質體的穩定性。同時，丙二醇作為透皮吸收促進劑時，單獨應用的效果不佳，而與其他促進劑合用，可增加藥物及促進劑的溶解度。丙二醇與乙醇合用，與普通醇質體相比，既可產生顯著的促透協同作用，也可增加藥物的溶解度［10］。

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