瘤果黑種草子提取物對慢性阻塞性肺病大鼠模型肺部炎癥的影響

耿東升， 李學強， 陳雪蓮， 陳 明

(新疆軍區聯勤部藥品儀器檢驗所，新疆 烏魯木齊830063)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是以氣流受限為主要特征，與肺部的異常炎癥反應有關［1］。目前認為氣道慢性炎癥反應是造成慢性阻塞性肺病的主要原因，炎癥細胞的趨化、激活及炎癥因子的釋放是慢性阻塞性肺病氣道慢性炎癥的中心環節［2］。本實驗將采用脂多糖加霧化吸入木瓜蛋白酶建立慢性阻塞性肺病大鼠模型探討瘤果黑種草子提取物(油脂、非油脂)對該疾病肺部炎癥的影響，并初步研究其抗炎作用機制。

1 材料

1.1 藥物與試劑 瘤果黑種草子購自新疆和田墨玉縣，經新疆中藥民族藥研究所研究員李曉瑾鑒定為Nigella Glandulifera Freyn 的種子，批號2011308;稱取干燥已粉碎黑種草子置于超臨界CO2萃取釜中，經預實驗確定萃取條件(萃取溫度40 ℃，萃取壓力29 MPa，解析壓力I 12 MPa，溫度56 ℃，解析壓力II 6 MPa，溫度50 ℃，萃取時間2 h，)至萃取物不再增加為止，收集超臨界萃取物即為黑種草子中的油脂類，油脂類加入2%吐溫-80，配成相應給藥質量濃度溶液;萃取釜中的草子即為黑種草子的非油脂類，非油脂類溶于0.5% CMC-Na，配成相應給藥質量溶液;戊巴比妥鈉(25 g/瓶，中國醫藥集團上海化學試劑公司，批號F20030816);脂 多 糖 (lipopolysaccharides，LPS)(10 mg/支，美國Sigma 公司，批號L2880);木瓜蛋白酶(5 g/瓶，美國Sigma 公司，批號20120630);氨茶堿(0.1 g/片，四川錫成藥業有限公司，批號11070203);大鼠TNFα、IL-8、NF-κB 酶聯免疫分析試劑盒，購于上海依科賽生物科技有限公司。

1.2 動物 SD 大鼠，雄性，清潔級，體質量180 ～220 g，購自于新疆醫科大學實驗動物中心，生產許可證號為SCXK (新)2011-0004。

1.3 儀器 AB104-N 型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);3K30 型低溫超速離心機(美國Sigma 公司);HV-20 型無油空壓機 (濟南浩偉實驗儀器有限公司);xMark 酶標分析儀(美國BIO-RAD 公司);CX31 光學顯微鏡(日本OLYMPUS 公司)。

2 方法

2.1 慢性阻塞性肺病大鼠模型的建立［3-6］造模組于實驗第l、15 日，采用0.3%戊巴比妥鈉溶液0.01 mL/g 腹腔注射麻醉大鼠后仰臥位固定于操作臺，在無菌條件下切開頸部正中皮膚，鈍性分離各層組織后暴露氣管，1 mL 注射器針頭刺入大鼠氣管軟骨環間隙，緩慢注入1 mg/mL LPS 200 μL于氣管內，正常對照組在相同條件下注入等體積生理鹽水，后即刻縫合切口并做消毒處理，注藥后將大鼠直立，左右旋轉3 min，使藥液在肺部分布均勻，清醒后常規飼養3 d 后各組大鼠霧化吸入木瓜蛋白酶5 g/L，每5 只大鼠2 mL，每次10 min，隔日重復5 次，造模期28 d。

2.2 分組與給藥 將56 只大鼠隨機分成7 組(每組8只)，分別為正常對照組、模型組、氨茶堿陽性對照組、油脂低、高劑量組，非油脂低、高劑量組，造模結束后各組分別灌胃給藥1 次/d，連續20 d。正常對照組和模型組灌胃等體積的生理鹽水。

2.3 一般狀況觀察 觀察各組大鼠在給藥20d 期間體質量、毛色、活動量、對外界的靈敏度、飲食、飲水、呼吸狀態等狀況。

2.4 標本采集與處理［7-11］采用0.3%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉后，股動脈放血處死動物。沿氣管打開胸腔分離出肺組織，結扎左側支氣管，將3 mL 生理鹽水由支氣管注入右肺，用手輕揉捏肺臟約30 s，隨后抽取灌洗液，重復2 次，回收約4 mL。取左肺10%中性甲醛固定后送病理。將灌洗液4 ℃下以1 500 r/min 低溫離心15 min，留取上清液-70 ℃冰凍，備檢，余液取細胞沉渣進行炎性細胞分類。

2.5 各組大鼠肺泡灌洗液中相關指標檢測［10］各組大鼠肺泡灌洗液離心后取細胞沉渣進行瑞士-吉姆薩染色涂片，在光學顯微鏡下觀察100 ～200 個細胞，然后對炎性細胞進行分類;采用ELISA 法檢測各組大鼠肺泡灌洗液上清液中TNF-α、IL-8 和NF-κB 的水平，各指標均嚴格按照試劑盒說明書操作測定。

2.6 肺組織病理學觀察［12］取左肺下葉用10%中性甲醛固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，4 μm 厚度連續切片2張，進行HE 染色，作病理切片檢查。光學顯微鏡下觀察大鼠肺組織病理形態學改變并作比較。

3 結果

3.1 大鼠一般狀況觀察 正常對照組大鼠活潑好動，毛發光澤，進食、進水正常，呼吸平穩，實驗期間體質量穩定增加;模型組大鼠拱背豎毛疲軟，被毛萎黃有脫落，進食進水量減少，活動性較差，精神萎靡，經常伴有咳嗽及噴嚏，呼吸急促，體質量增長緩慢。油脂、非油脂各給藥組和氨茶堿組大鼠的生存狀況明顯好于模型組。

3.2 對慢性阻塞性肺病大鼠肺泡灌洗液中炎癥細胞的影響模型組大鼠肺泡灌洗液中巨噬細胞、中性粒細胞所占比例顯著升高，淋巴細胞比例顯著降低，與正常組比較有統計學意義(P ＜0.01);氨茶堿組、油脂和非油脂低、高劑量組均可使巨噬細胞、中性粒細胞所占比例明顯降低，淋巴細胞比例明顯升高，與模型組比較有統計學意義(P ＜0.01，P ＜0.05)，結果見表1。

3.3 對慢性阻塞性肺病大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子水平的影響 模型組大鼠肺泡灌洗液上清液中TNF-α、IL-8 和NFκB 的水平顯著升高，與正常組比較有統計學意義(P ＜0.01);氨茶堿組、油脂和非油脂低、高劑量組均可不同程度使慢性阻塞性肺病模型大鼠的TNF-α、IL-8 及NF-κB 的水平降低，與模型組比較具有統計學意義(P ＜0.01，P ＜0.05)，結果見表2。

表1 對慢性阻塞性肺病大鼠肺泡灌洗液中炎性細胞的影響(±s，n=8)

表1 對慢性阻塞性肺病大鼠肺泡灌洗液中炎性細胞的影響(±s，n=8)

注:與正常對照組比較，▲▲P ＜0.01，▲P ＜0.05;與模型組比較，＊＊P ＜0.01，*P ＜0.05

組別 劑量/(mg·kg -1)炎性細胞分類巨噬細胞 中性粒細胞 淋巴細胞正常- 0.18±0.03 0.11±0.01 0.71±0.03模型 - 0.34±0.02▲▲ 0.20±0.02▲▲ 0.45±0.03▲▲氨茶堿 71.5 0.22±0.02＊＊ 0.15±0.02＊＊ 0.63±0.02＊＊油脂 193 0.29±0.04* 0.19±0.02 0.52±0.05*772 0.25±0.02＊＊ 0.15±0.03＊＊ 0.60±0.02＊＊非油脂 450 0.24±0.03＊＊ 0.16±0.03＊＊ 0.60±0.04＊＊1 800 0.29±0.03* 0.17±0.02* 0.54±0.03*

3.4 對慢性阻塞性肺病大鼠肺組織病理形態學的影響 大體標本肉眼所見:正常對照組大鼠兩肺外表光滑柔軟，呈淡粉肉色，肺部體積大小適中，抽吸灌洗液時彈性較好;模型組大鼠兩肺外表粗糙略硬，呈暗紅偏紫并有凹凸不平蒼白灶，肺部體積明顯增大，彈性較差。給藥20 d 后，油脂和非油脂各治療組大鼠雙肺外表較光滑、彈性較好、體積無明顯改變，與模型組比較總體改善較明顯，但比氨茶堿組效果差。光鏡HE 染色所見:正常對照組支氣管黏膜上皮細胞排列整齊，支氣管黏膜下未見明顯炎細胞浸潤，

表2 對慢性阻塞性肺病大鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-8及NF-κB 水平的影響(±s，n=8)

表2 對慢性阻塞性肺病大鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-8及NF-κB 水平的影響(±s，n=8)

組別劑量/(mg·kg -1)TNF-α/(ng·mL -1)IL-8/(ng·mL -1)NF-κB/(ng·mL -1)- 0.23±0.02 0.49±0.07 0.40±0.03模型 - 0.37±0.05▲▲ 0.98±0.05▲▲ 0.86±0.24▲▲氨茶堿 71.5 0.27±0.03＊＊ 0.59±0.06＊＊ 0.52±0.13＊＊油脂 193 0.31±0.02 0.84±0.15 0.63±0.22 772 0.30±0.05* 0.81±0.14* 0.58±0.11*非油脂 450 0.30±0.04＊＊ 0.68±0.06＊＊ 0.56±0.17＊＊1 800 0.31±0.05* 0.80±0.15* 0.62±0.16對照*

注:與正常對照組比較，▲▲P ＜0.01，▲P ＜0.05;與模型組比較，＊＊P ＜0.01，*P ＜0.05肺泡壁完整，氣管纖毛無損傷脫落，肺泡結構連續，肺泡腔無擴大。慢性阻塞性肺病模型組支氣管黏膜上皮變性壞死脫落，杯狀細胞增生，局部有鱗狀上皮化生，炎細胞浸潤(淋巴細胞為主)，管壁肌層斷裂，肺泡腔、支氣管腔有滲出物，肺泡壁肌層斷裂、擴張融合，肺組織結構破壞明顯。給藥20 d 后，油脂、非油脂各治療組大鼠炎性細胞浸潤較少，有部分肺泡擴張融合，有些肺泡腔有部分擴大，氣管內黏膜纖毛細胞數量較多，排列較整齊，肺組織結構破壞有不同程度的緩解，但比氨茶堿改善效果差，見圖1。

圖1 光鏡下肺組織病理學改變(HE×100)

4 討論

目前，國內外對果黑種草、黑種草的研究已較多，但對于瘤果黑種草僅限于部分化學及醇提物的體外抗氧化、黑種草子油抗血栓作用的研究，而該藥關于慢性阻塞性肺病藥理作用有效部位的研究，并未見報道。本實驗首次對瘤果黑種草子提取物進行了慢性阻塞性肺病相關作用機制的研究。

本實驗在借鑒國內外建立慢性阻塞性肺病動物模型方法的基礎上加以改進，采用氣管內注入LPS 和霧化吸入木瓜蛋白酶聯合復制慢性阻塞性肺病模型［13-15］，病理組織學觀察發現模型大鼠出現慢性支氣管炎及肺氣腫的特征性改變:支氣管管壁結締組織增生，平滑肌增厚，支氣管纖毛上皮呈鋸齒樣增生增厚并有脫落，可見巨噬細胞和淋巴細胞浸潤，肺泡結構紊亂，肺泡間隔破裂，肺泡腔不規則擴大，部分相互融合成肺大泡等，證實慢性阻塞性肺病大鼠模型建立成功。經過瘤果黑種草子油脂、非油脂治療后，模型大鼠肺組織病理改變程度明顯減輕，肺泡巨噬細胞、中性粒細胞所占炎性細胞比例與模型組相比明顯降低，同時該藥物也降低了大鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-8 與NF-κB的水平，實驗結果說明瘤果黑種草子油脂、非油脂有減輕慢性阻塞性肺病大鼠模型肺部炎癥的作用，其抗炎機制可能與減弱了肺組織內的巨噬細胞對LPS 的反應，減少炎癥因子的合成和釋放有關。我們將進一步研究和確定瘤果黑種草子油脂、非油脂發揮炎癥作用的具體有效部位。

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