枸杞總多糖對(duì)2 型糖尿病大鼠的降糖作用研究

尹長(zhǎng)江， 楊坤寶， 張學(xué)軍， 宋鴻儒

(承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德067000)

枸杞Lycium chinense 是茄科枸杞屬的多分枝灌木植物。《本草綱目》記載:“春采枸杞葉，名天精草;夏采花，名長(zhǎng)生草;秋采子，名枸杞子;冬采根，名地骨皮”。果實(shí)稱枸杞子，作為藥食兩用的原料，自古以來(lái)，中醫(yī)就將枸杞子作為補(bǔ)益肝腎及明目的中藥應(yīng)用于臨床［1］。枸杞多糖是傳統(tǒng)中藥枸杞子的主要活性組分之一，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有降血糖、降血脂、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫及抗氧化等多種生物學(xué)活性，具有良好的藥用開(kāi)發(fā)價(jià)值［2-3］。本研究擬通過(guò)免疫學(xué)和形態(tài)學(xué)方法探討枸杞總多糖對(duì)2 型糖尿病大鼠糖代謝和胰島組織形態(tài)的影響，闡明枸杞總多糖對(duì)2 型糖尿病大鼠的降糖作用，旨在為綜合開(kāi)發(fā)利用枸杞總多糖應(yīng)用于2 型糖尿病的臨床防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 wistar 大鼠，雄性，體質(zhì)量(160 ±10)g，購(gòu)自北京維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)為SCXK (京)2010-0016。基礎(chǔ)飼料、高脂高糖飼料均購(gòu)自北京維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，高脂高糖飼料配方為:15%蔗糖，10%豬油，1.5%膽固醇，1.0%膽酸鈉，63.5%基礎(chǔ)飼料。

1.1.2 藥物 寧夏枸杞子Lycium barbarum L. 的干燥成熟果實(shí)，購(gòu)自河北承德市中藥材科技開(kāi)發(fā)公司。枸杞總多糖由本實(shí)驗(yàn)室從枸杞子中提取。具體方法為:將枸杞子60 ℃條件下烘干、研磨成粉，稱取50 g。經(jīng)石油醚回流脫脂-95%乙醇洗滌-熱水浸提多糖-旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮沉淀得到粗提物-去蛋白-層析柱純化過(guò)濾得到精制多糖。多糖的回收率及成分測(cè)定采用苯酚—硫酸法［4］，檢測(cè)得到多糖的提取率為5.27%，多糖含有量為24.2%，產(chǎn)量和純度均較為理想，適用于藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。

1.1.3 主要儀器 RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);層析柱(上海華美實(shí)驗(yàn)儀器廠);UV-2100 紫外分光光度計(jì)(上海龍尼柯儀器有限公司);M-300 半自動(dòng)生化分析儀(荷蘭威圖儀器科學(xué)公司);HH6003 γ-放射免疫分析儀(北京核海高技術(shù)開(kāi)發(fā)公司);H-8100 透射電子顯微鏡(日本Hitachi 公司);E1000 型生物顯微鏡(日本尼康公司)。

1.2 方法

1.2.1 2 型糖尿病大鼠模型制備 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，給予高脂高糖飼料，喂養(yǎng)4 周后，禁食12 h，以40 mg/kg劑量腹腔注射STZ。繼續(xù)高脂高糖飼料喂養(yǎng)1 周后，禁食12 h，采用毛細(xì)玻璃管從大鼠內(nèi)眥靜脈取血1 mL，測(cè)定大鼠的空腹血糖，以空腹血糖≥7.8 mmol/L 作為判斷2 型糖尿病免疫模型造模成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 隨機(jī)選取糖尿病模型大鼠40 只，均分為5 組:模型組，枸杞總多糖低劑量(100 mg/kg)、中劑量(200 mg/kg)、高劑量(400 mg/kg)干預(yù)組，格列苯脲干預(yù)組(即陽(yáng)性藥物組，給藥劑量為5 mg/kg);另取基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)且體質(zhì)量相近的大鼠8 只作為正常對(duì)照組。其中3 個(gè)多糖干預(yù)組和格列苯脲干預(yù)組大鼠每天灌胃相應(yīng)劑量的藥物(溶于0.9%生理鹽水)，而正常對(duì)照組和糖尿病免疫模型組大鼠則每天灌胃同等容積的0.9%生理鹽水，持續(xù)灌胃4 周。試驗(yàn)過(guò)程中除正常對(duì)照組大鼠以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)外，其余各組大鼠均喂以高脂高糖飼料。

1.2.3 血液相關(guān)指標(biāo)測(cè)定 灌胃4 周后，各組大鼠禁食12 h，采用10 mg/mL 戊巴比妥鈉以45 mg/kg 劑量腹腔麻醉大鼠，從各組大鼠的腹主動(dòng)脈取血5 mL，4 ℃下3 000 r/min離心10 min 分離血清和血漿，根據(jù)各試劑盒說(shuō)明測(cè)定血液相關(guān)指標(biāo)。血清中空腹胰島素(FINS)和C-肽采用放射免疫法測(cè)定;血糖(FBG)采用酶法測(cè)定;血漿中糖化血紅蛋白(HbA1c)采用糖化血紅蛋白分析儀測(cè)定。

1.2.4 胰腺組織HE 染色 取固定于10%中性甲醛溶液中的大鼠胰腺組織，依次經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯透明后行常規(guī)石蠟包埋，5 μm 連續(xù)切片，然后進(jìn)行HE 染色，中性樹(shù)膠封片后，將切片置于光學(xué)顯微鏡下觀察胰腺組織形態(tài)。

1.2.5 胰腺組織超微結(jié)構(gòu)觀察 各組隨機(jī)取3 只大鼠，經(jīng)1 g/L戊巴比妥鈉腹腔麻醉后打開(kāi)腹腔，迅速取少許胰腺尾部組織，經(jīng)2.5%戊二醛固定液前固定，1%鋨酸溶液后固定，50 nm 超薄切片，乙酸鉛和乙酸鈾電子染色后，透射電子顯微鏡觀察、攝片，觀察胰島細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.3 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)分析程序?qū)υ囼?yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間兩兩比較用LSD-t 檢驗(yàn)，組間差異顯著性用方差分析法檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 枸杞總多糖對(duì)2 型糖尿病大鼠糖代謝相關(guān)指標(biāo)的影響由表1 可以看出，經(jīng)LBP 干預(yù)治療后糖尿病大鼠的空腹血糖水平高于正常對(duì)照組，且在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中一直持續(xù)著高血糖狀態(tài)。而LBP 干預(yù)治療能夠顯著地降低糖尿病大鼠的血糖，且這種治療作用呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，尤其是LBP 高劑量干預(yù)組，與陽(yáng)性對(duì)照藥物格列苯脲的治療效果相似。模型組大鼠的FINS、C-P 和HbA1c 水平均極顯著低于正常對(duì)照組大鼠，而LBP 干預(yù)組大鼠的FINS 和C-P水平明顯升高，HbA1c 水平則明顯降低且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。結(jié)果表明，枸杞總多糖的降血糖作用可能與其能促進(jìn)糖尿病模型大鼠的胰島素分泌和釋放有關(guān)。

2.2 枸杞總多糖對(duì)2 型糖尿病大鼠胰腺組織形態(tài)的影響由圖1 可以看出，正常對(duì)照組大鼠胰腺中胰島組織與腺泡之間界限清晰，胰島細(xì)胞豐富，分布均勻，形態(tài)規(guī)則(圖1-A);而模型組大鼠胰島組織明顯萎縮，胰島與腺泡脫離，胰島細(xì)胞明顯減少，且部分細(xì)胞呈現(xiàn)出變性、核固縮現(xiàn)象(圖1-B);LBP (圖1-C ～E)和陽(yáng)性藥物格列苯脲干預(yù)組(圖1-F)大鼠胰島組織形態(tài)明顯改善，尤其以LBP 高劑量干預(yù)組(圖1-E)和格列苯脲干預(yù)組的治療效果最為明顯，胰島細(xì)胞較多，排列整齊，組織形態(tài)基本恢復(fù)正常。結(jié)果表明，枸杞多糖對(duì)糖尿病大鼠的胰島組織具有明顯的保護(hù)作用。

表1 枸杞總多糖對(duì)2 型糖尿病大鼠FBG，F(xiàn)INS，C-P 和HbA1c 的影響(±s，n=8)

表1 枸杞總多糖對(duì)2 型糖尿病大鼠FBG，F(xiàn)INS，C-P 和HbA1c 的影響(±s，n=8)

注:與模型組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 給藥劑量/(mg·kg -1) FBG/(mmol·L -1) FINS/(μIU·mL -1) C-P/(pmol·mL -1) HbA1c(μmol/L -1)正常對(duì)照組 - 4.56 ±0.43＊＊ 11.31 ±1.19＊＊ 0.36 ±0.03＊＊ 1.21 ±0.11＊＊模型組 - 12.59 ±1.13 4.76 ±0.52 0.12 ±0.01 2.49 ±0.26 LBP 低劑量干預(yù)組 100 9.26 ±0.89* 5.92 ±0.57* 0.17 ±0.01* 2.21 ±0.24*LBP 中劑量干預(yù)組 200 8.19 ±0.76＊＊ 7.92 ±0.72* 0.22 ±0.02* 2.01 ±0.21*LBP 高劑量干預(yù)組 400 6.76 ±0.59＊＊ 9.13 ±0.86＊＊ 0.28 ±0.03＊＊ 1.85 ±0.17*格列苯脲干預(yù)組 5 6.91 ±0.62＊＊ 9.21 ±0.89＊＊ 0.29 ±0.03＊＊ 1.87 ±0.17*

圖1 枸杞總多糖對(duì)2 型糖尿病大鼠胰腺組織形態(tài)的影響(×400)

2.3 枸杞總多糖對(duì)2 型糖尿病大鼠胰腺超微結(jié)構(gòu)的影響各組大鼠胰腺超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖中可知，正常對(duì)照組大鼠胰島β 細(xì)胞胞核呈規(guī)則的卵圓形，染色質(zhì)均勻，核仁清晰，胞漿內(nèi)胰島素分泌顆粒豐富(圖2-A);而模型組大鼠胰島β 細(xì)胞胞核明顯固縮，核仁消失，染色質(zhì)邊集，胰島素分泌顆粒大量減少，電子密度較低(圖2-B);LBP低劑量干預(yù)組大鼠的細(xì)胞核也有固縮和染色質(zhì)邊集現(xiàn)象，分泌顆粒較少，但與模型組相比，各細(xì)胞器病理變化有所減輕(圖2-C);LBP 中劑量干預(yù)組大鼠的胰島細(xì)胞線粒體空泡與腫脹病變明顯好轉(zhuǎn)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒程度減輕(圖2-D);而LBP 高劑量干預(yù)組(圖2-E)和陽(yáng)性藥物格列苯脲對(duì)照組大鼠(圖2-F)的胰島細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)與正常對(duì)照組無(wú)明顯差異，胞核規(guī)則，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)結(jié)構(gòu)均接近于正常對(duì)照組。枸杞總多糖低、中、高3 個(gè)劑量組對(duì)2型糖尿病大鼠的胰島細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)都有一定的改善作用，其中以400 mg/kg 時(shí)改善作用最為明顯。

3 討論

糖代謝紊亂是糖尿病的重要病理生理學(xué)基礎(chǔ)，是糖尿病患者血糖失衡的重要原因之一［5-6］。因此，調(diào)節(jié)糖代謝、維持血糖平衡是治療糖尿病的一個(gè)重要途徑［7-8］。目前普遍認(rèn)為高脂高糖飲食聯(lián)合小劑量注射STZ 的方法誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型與人類的2 型糖尿病極為相似，其主要以血糖升高、胰島細(xì)胞功能受損以及免疫功能下降等為主要特征［9］。因此，本研究所建立的動(dòng)物模型的發(fā)病機(jī)制和特征與2 型糖尿病患者的臨床發(fā)病過(guò)程和代謝特征較為相似，保證了糖尿病模型的可靠性，為枸杞總多糖藥理學(xué)研究提供了良好的動(dòng)物模型。

圖2 枸杞總多糖對(duì)2 型糖尿病大鼠胰腺超微結(jié)構(gòu)的影響

血糖升高和胰島素分泌減少是2 型糖尿病的主要特征，本研究采用高、中、低3 個(gè)劑量的枸杞總多糖干預(yù)治療糖尿病大鼠，結(jié)果表明，枸杞總多糖可有效控制糖尿病大鼠的血糖水平，提高其機(jī)體胰島素水平，該結(jié)果可作為枸杞總多糖降血糖的主要證據(jù)［10］。此外，血清中C 肽的增多也佐證了枸杞總多糖治療組大鼠機(jī)體內(nèi)胰島素分泌功能得到改善，進(jìn)而促進(jìn)了糖代謝，使血液中葡萄糖量顯著減少，進(jìn)而緩解了糖尿病大鼠機(jī)體的高血糖狀態(tài)。體內(nèi)長(zhǎng)期持續(xù)的高血糖狀態(tài)可通過(guò)氧化應(yīng)激或非氧化應(yīng)激反應(yīng)等途徑誘發(fā)胰島細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量減少，胰島素分泌量降低［11-12］;另外，高血糖或游離脂肪酸所造成的氧化應(yīng)激或非氧化應(yīng)激損傷可導(dǎo)致胰島細(xì)胞合成和分泌胰島素的功能受損，單個(gè)細(xì)胞分泌的胰島素減少［13-14］。因此，如何保護(hù)胰島細(xì)胞，促進(jìn)其合成與分泌胰島素是治療2 型糖尿病的又一關(guān)鍵所在。本研究中，2 型糖尿病大鼠的胰島組織形態(tài)結(jié)果表明，枸杞總多糖可有效地保護(hù)糖尿病大鼠胰島細(xì)胞，修復(fù)胰島組織損傷，進(jìn)而促進(jìn)胰島素的合成和分泌，這可能與其能降低糖尿病大鼠機(jī)體的氧化應(yīng)激水平有關(guān)。綜上，枸杞總多糖可有效控制2 型糖尿病大鼠的空腹血糖水平，調(diào)節(jié)糖代謝，減輕糖尿病大鼠胰島β 細(xì)胞損傷，促進(jìn)胰島β 細(xì)胞分泌胰島素，且枸杞總多糖對(duì)2 型糖尿病大鼠的治療作用呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。

［1］ 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所. 中藥志［M］. 北京:人民衛(wèi)生出版社，1982.

［2］ 左紅舉，喇萬(wàn)英. 枸杞多糖的降血糖作用及對(duì)糖尿病并發(fā)癥的研究現(xiàn)狀和展望［J］. 甘肅中醫(yī)，2009，22(4):77-79.

［3］ 王 玲，李維波. 枸杞多糖對(duì)糖尿病小鼠模型免疫功能的影響［J］. 上海免疫學(xué)雜志，2000，20(3):159-162.

［4］ Bergmmar M F，Gruppen G H. Optimisation of the selective extraction of glucrono-arabinoxylans from wheat bran:use of barium and calcium hydroxide solution at elevated temperatures［J］. J Cereal Sci，1996，23(3):235-245.

［5］ Wunderlich F T，Luedde T，Singer S，et al. Hepatic NF-kappa B essential modulator deficiency prevents obesity-induced insulin resistance but synergizes with high-fat feeding in tumorigenesis［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(4):1297-1302.

［6］ Michael J，F(xiàn)owler M D. Diabetes treatment part 2:oral agents for glycemic management［J］. Clin Dibetes，2007，25(4):131-134.

［7］ Xing X H，Zhang Z M，Hu X Z，et al. Antidiabetic effects of Artemisia sphaerocephala Krasch. gum，a novel food additive in China，on streptozotocin-induced type 2 diabetic rats［J］. J Ethnopharmacol，2009，125(3):410-416.

［8］ Salt I P，Johnson G，Ashcroft S J，et al. AMP-activated protein kinase is activated by low glucose in cell lines derived from pancreatic beta cells，and may regulate insulin release［J］. Biochem J，1998，335(3):533-539.

［9］ Cnop M，Welsh N，Jonas J C，et al. Mechanisms of pancreatic β-Cell death in type 1 and type 2 diabetes［J］. Diabetes，2005，54(S2):97-107.

［10］ Li X M. Protective effect of Lycium barbarum polysaccharides on streptozotocin-induced oxidative stress in rats［J］. Int J Biol Macromol，2007，40(12):461-465.

［11］ Cnop M，Welsh N，Jonas J C，et al. Mechanisms of pancreatic β-Cell death in type 1 and type 2 diabetes［J］. Diabetes，2005，54(S2):97-107.

［12］ Chao D T，Korsmeyer S J. BCL-2 family:regulators of cell death［J］. Annu Rev Immunol，1998，16(1):395-419.

［13］ Salt I P，Johnson G，Ashcroft S J，et al. AMP-activated protein kinase is activated by low glucose in cell lines derived from pancreatic beta cells and may regulate insulin release［J］. Biochem J，1998，335(3):533-539.

［14］ da Silva X G，Leclerc I，Varadi A，et al. Role for AMP-activated protein kinase in glucose-stimulated insulin secretion and preproinsulin gene expression［J］. Biochem J，2003，371(4):761-774.