化濁解毒方對濁毒內蘊型反流性食管炎大鼠黏膜腦腸肽及胃腸激素的影響

趙 艷， 馮玉彥

(河北省中醫院，河北 石家莊050011)

反流性食管炎(Reflux Esophagitis，RE)是一種胃食管反流病，由胃、十二指腸內容物，主要是酸性胃液或是酸性胃液加膽汁反流至食管所引起的食管黏膜的炎癥、糜爛、潰瘍的病變。隨著胃鏡檢測的普及、生活節奏加快、工作壓力增大和飲食結構改變，此病的發病率呈不斷上升趨勢。RE 反復發作引起Barrett 食管與食管癌的發生密切相關，因此越來越受到重視。筆者在臨床應用化濁解毒方治療該病取得較好療效。本實驗旨在通過觀察該方對濁毒內蘊反流性食管炎大鼠血清胃泌素 (GAS)、胃動素(MTL)及黏膜血管活性腸肽(VIP)、P 物質(SP)表達水平的影響，進一步探討該方治療RE 的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 12 周齡清潔級Wistar 雄性大鼠60 只，體質量250 ～320 g，購自河北醫科大學實驗動物中心。動物許可證號:SCXK (冀)2008-1-003。

1.2 藥物和試劑 公英15 g、連翹20 g、半邊蓮15 g、半枝蓮15 g、絞股藍15 g、白花蛇舌草15 g、黃芩9 g、石菖蒲15 g、紫豆蔻6 g、佩蘭12 g、藿香12 g、茯苓20 g、枳實12 g、厚樸12 g、砂仁12 g。所需藥物均購自河北省中醫院，以上藥物先經蒸餾水浸泡2 h，煎煮2 次 (30 min/次)后，過濾，合并濾液，再水浴濃縮成1.25 g/mL藥液備用。奧美拉唑腸溶片由湖南方盛制藥有限公司生產，并以蒸餾水配制成0.36 mg/mL 的溶液備用。胃泌素(GAS)、胃動素(MTL)酶聯免疫檢測試劑盒，由上海源葉生物科技有限公司提供。血管活性腸肽(VIP)、P 物質(SP)即用型SABC 免疫組化染色試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。

2 試驗方法

2.1 動物分組 將60 只大鼠按隨機數字表法分為空白組、模型組、陽性藥組、化濁解毒方組，每組15 只，除空白組外，其余各組大鼠采用“不全幽門結扎+賁門肌切開術”并配合濕熱環境加高脂高糖飲食的綜合方法制作RE 動物模型。

2.2 造模 參考文獻［1-2］制備大鼠模型。(1)造模前大鼠適應性飼養7 d，術前24 h 內禁食 (但不禁水)，將3.5%水合氯醛(按1 mL/100 g)注射到腹腔，進行麻醉，取仰臥位將大鼠固定在手術臺上，常規備皮、消毒，沿上腹部正中線切開約3 cm，將食管下段及胃食管交界區完全暴露，用0 號縫合線結扎胃-食管交界處的胃左動脈分支，防止造模過程中因切開賁門肌而出血，取食管-胃交界處縱行切開賁門肌約0.5 cm，分離使切開的賁門部位黏膜層完全暴露于視野中，使反流的作用效果更強。然后避開血管結扎幽門與十二指腸交界近幽門部，為防止感染，關腹前做消毒處理，將生理鹽水1 mL 及慶大霉素1 萬IU 注入腹腔，大鼠術后禁食(不禁水)24 h。(2)除空白組外，其他各組大鼠飼養于潮濕高熱的環境中，飼以高脂高糖飲食，即在普通飼料喂養的基礎上，每日每只加用10% 蜂蜜，10%白糖混合飲料自由飲用，術后3 周即造模成功。

2.3 給藥方法 造模3 周后開始給藥，空白組、模型組均按1 mL/100 g 給予生理鹽水灌胃;陽性藥組按1 mL/100 g(即按3.6 mg/kg)給予奧美拉唑溶液灌胃;化濁解毒方組按1 mL/100 g (即按12.5 g/kg)給予化濁解毒方灌胃。以上各組均每日給藥1 次，共治療8 周。

2.4 標本采集與處理 治療8 周后，禁食不禁水24 h，使用2%戊巴比妥鈉40 mg/kg 行腹腔注射麻醉。每只大鼠從門靜脈取血4 mL，注入含有7.5%EDTA 二鈉30 μL 和抑肽酶40 μL 的試管中混勻，在4 ℃3 000 r/min 條件下離心10 min，抽取上清液置-80 ℃冷藏箱內待測。處死大鼠，取各組大鼠食管下段標本，放入10%甲醛固定24 h 后脫水，常規石蠟包埋切片，一部分常規HE 染色，另一部分免疫組化監測。

2.5 觀測指標與檢測方法

2.5.1 食管黏膜病理組織觀察 參照2003 年中華醫學會消化內鏡學分會制定的“反流性食管炎診斷及治療指南”中反流性食管炎分級標準:鱗狀上皮增生、黏膜固有層乳頭延伸、上皮細胞層內炎細胞浸潤為輕度;輕度基礎上出現黏膜糜爛為中度;輕度基礎上有潰瘍形成和(或)Barrett 食管改變為重度［3］。

2.5.2 胃腸激素水平檢測 取分離備用血清，采用酶聯免疫吸附法測定GAS、MTL 水平，嚴格按試劑盒說明書步驟操作。操作步驟:設置空白對照(血清樣本稀釋液)，將對照品各50 μL 依次加入孔中，其余各孔加樣品血清50 μL。樣品孔中加入生物素標記液10 μL，在對照品孔和樣品孔中加入酶標記液100 μL，將反應板充分混勻后放置36 ℃溫育1 h。用洗滌液將反應板清洗5 次后每孔加入底物A，B 液各50 μL，36 ℃避光暗處溫育反應15 min。每孔加入50 μL 終止液混勻。TECAN 多功能酶標儀測定450 nm吸光度 (A)。根據標準曲線回歸方程計算GAS、MTL含量。

2.5.3 食管黏膜中VIP 及SP 表達的檢測 采用SABC 法，操作嚴格按試劑盒說明進行。操作步驟:脫蠟沖洗組織切片后，浸泡入3%H2O2約10 min，修復抗原后用PBS 洗5 min，加入血清封閉液，放入溫箱(37 ℃)0.5 h。滴加Ⅰ抗，置37 ℃溫箱1 h。從溫箱中取出用PBS 洗3 次每次5 min。滴加Ⅱ抗，37 ℃溫箱30 min 后PBC 洗3 次每次5 min。滴加試劑SABC，37 ℃0.5 h 后用PBS 洗4 次每次5 min。加DAB 顯色，蒸餾水洗。蘇木素復染2 min、鹽酸酒精分化。脫水、透明、封片、鏡檢。進行食管黏膜中VIP及SP 表達的檢測。

3 統計學方法

采用SPSS 17.0 統計分析軟件，對資料進行分析處理。計量數據采用±s 表示，采用t 檢驗;等級資料采用非參數檢驗。

4 結果

4.1 食管黏膜病理組織觀察 由表1 可見，化濁解毒方組、陽性藥對照組與模型組比較有統計學意義 (P ＜0.05)，均能改善食管黏膜病理變化。

表1 各組大鼠病理分級比較

4.2 各組胃腸激素水平比較 由表2 可見，反流性食管炎大鼠模型組血清GAS 水平顯著下降(P ＜0.05)，而MTL水平無明顯變化(P ＞0.05)。與模型組比較，化濁解毒方組血清GAS、MTL 水平顯著升高(P ＜0.05)，而陽性藥對照組僅血清GAS 水平升高(P ＜0.05)，MTL 變化不明顯(P ＞0.05)。

表2 各組大鼠血GAS 及MTL 水平的比較(±s)

表2 各組大鼠血GAS 及MTL 水平的比較(±s)

注:與空白組比較，*P ＜0.05;與模型組比較，△P ＜0.05

組別 例數 GAS/(ng·L -1) MTL/(ng·L -1)15 56.72 ±5.31 136.58 ±7.54模型組 13 40.98 ±3.17* 141.61 ±9.36陽性藥組 14 68.62 ±4.96＊△ 139.78 ±8.91化濁解毒方組 14 65.26 ±4.43＊△ 163.16 ±9.12空白組△

4.3 各組大鼠食管黏膜VIP、SP 表達比較 由表3 可見，模型組大鼠食管黏膜VIP 表達升高，SP 表達降低，與空白組比較，有顯著性差異(P ＜0.05)。化濁解毒方組與陽性藥組大鼠食管黏膜VIP 表達降低，SP 表達升高，與模型組比較，有顯著性差異(P ＜0.05)。化濁解毒方組與陽性藥組比較，SP 表達升高，有顯著性差異(P ＜0.05);而VIP表達，兩者比較無顯著性差異(P ＞0.05)。

表3 各組大鼠食管黏膜VIP、SP 表達比較(±s)

表3 各組大鼠食管黏膜VIP、SP 表達比較(±s)

注:與空白組比較，* P ＜0.05;與模型組比較，＊＊P ＜0.05;與陽性藥組比較，△P ＜0.05

組別 例數VIP SP空白組15 82.05 ±9.28 164.56 ±9.43模型組 13 142.51 ±11.48* 122.83 ±11.32*陽性藥組 14 101.02 ±13.62＊＊ 138.33 ±13.54＊＊化濁解毒方組 14 103.38 ±12.16＊＊ 156.07 ±10.83＊＊△

5 討論

反流性食管炎是消化系統常見病，主要是胃和十二指腸內容物反流至食管所引起的食管黏膜病變。本病病程較長，反復發作，治療難度較大。多數學者認為RE 發病機理為抗反流防御機制減弱和反流物對食管黏膜攻擊作用的結果，而防御機制的減弱與下食管括約肌壓力下降、食管胃動力障礙相關［4］。胃泌素(GAS)和胃動素(MTL)是重要的胃腸激素［5］。GAS 是由胃竇及十二指腸黏膜開放型G 細胞分泌，有保護胃黏膜和促進胃腸道分泌的功能，對胃排空有重要作用［6］。MTL 是由22 個氨基酸組成的直鏈多肽，具有促進胃腸收縮及小腸分解運動提高食管下括約肌緊張性的作用［7］，有助于胃腸運動和胃排空。MTL、GAS、P 物質(SP)等可增強下食管括約肌;血管活性腸肽(VIP)、生長抑素、抑胃肽等可減弱下食管括約肌［8］。相關研究表明:GAS 和MTL 的異常降低可導致胃排空障礙，致使胃酸反流引發該病［9-10］。而VIP 為抑制性神經遞質，主要以神經分泌方式作用于下食管括約肌，為介導其松弛的重要原因之一;SP 則為主要興奮性肽能神經遞質，其胞體發出纖維達到食管壁各層，興奮時可引起下食管括約肌收縮，SP 神經元減少或功能降低，VIP 神經元的異常升高是RE 發病機制之一［11］。

實驗結果顯示，化濁解毒方能夠降低大鼠食管黏膜VIP 表達，升高血清GAS、MTL 水平及黏膜SP 表達，改善大鼠病理損傷，說明本方可能是通過雙向調控機制，調節機體內正負相關因子而達到治療效果。

對于本病的治療目前西醫主要采用抑酸藥、促胃動力藥物對癥治療，短期療效較好，但癥狀易復發，需長期用藥維持治療，患者依從性較差。中醫藥治療RE 從整體觀念出發，通過辨證論治對本病的病因、病機及診療有系統而獨特的見解，課題組經多年臨床研究發現RE 病因多為六淫傷中，情志不遂，飲食不適而內傷脾胃，中焦失司，氣機郁滯，逆亂失和，脾胃不能升清降濁，則水反為濕，谷反為滯，濕滯日久化生熱毒，濕熱毒邪互結而釀生濁毒。病機常表現為氣機郁滯、濕熱內阻、濁毒內蘊、瘀血停滯、陰液虧虛，可單一為病又多相兼為害，而濕濁和熱毒是本病發病和病機演變的關鍵。基于此課題組采用化濁解毒方治療該病。方中重用石菖蒲、砂仁化濕和胃健脾。公英、連翹清熱解毒，公英兼以利濕，連翹又可輕宣郁熱取“火郁發之”之意。上四味共為君藥。紫豆蔻、藿香、佩蘭增強君藥醒脾開胃，芳香化濕和胃之效;黃芩、半邊蓮、半枝蓮、白花蛇舌草助君藥清熱解毒祛濕，共為臣藥。絞股藍、茯苓益氣健脾滲濕，化濕可祛脾病之因，健脾可絕生濕之本;配以枳實、厚樸理氣消痞，降逆除脹，而復脾胃升清降濁之功，同為佐使藥。實驗結果表明，化濁解毒方針對本病關鍵病機濁毒用藥，標本兼治，使濁邪祛，毒邪解。能夠促進GAS、MTL 的分泌，進而促進胃腸的運動，降低反流物對食管的損傷。同時提高SP 表達，降低VIP 的表達，起到雙向調節作用，既能夠降低胃酸侵害，抗氧化、抗菌抗炎從而減輕對食管黏膜的破壞，又能夠增強免疫力、提高保護機制進而加強自身抗病和修復能力，使食管黏膜得以修復。

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