HPLC 法測定不同產(chǎn)地竹葉柴胡中柴胡皂苷a、d

王建科， 李 瑋， 林 昶， 陳敏紅

(貴陽中醫(yī)學院，貴州 貴陽550002)

竹葉柴胡為傘形科植物膜緣柴胡Bupleurum marginatum Wall. ex. Dc. 的干燥根及全草［1］。性苦、辛，微寒，具解表和里、升陽解郁之功效，用于寒熱往來，胸滿，脅痛，口苦，瘧疾，脫肛，中氣不足，月經(jīng)不調(diào)等癥［2］。分布于陜西、湖北、四川、云南、貴州、湖南等省區(qū)，為常用中藥柴胡的三大來源之一［3］，西南地區(qū)將竹葉柴胡作為柴胡使用［4］，且使用量大。柴胡皂苷具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)等作用，國內(nèi)外學者把柴胡皂苷應用于腎病、肝纖維化、腫瘤方面，取得了可喜的成就［5］。竹葉柴胡中含有皂苷(a、d、b2、b4)、柴胡色原酮A，白花前胡丙素，木糖醇等成分［6］。《中國藥典》2010 年版收載了柴胡和狹葉柴胡的柴胡皂苷a、d 的定量測定方法［7］，文獻報道柴胡皂苷a、d 的測定方法也較多［8-15］，但采用這些方法均未得到竹葉柴胡中柴胡皂苷a、d 的良好分離，同時有關(guān)竹葉柴胡中的柴胡皂苷a、d 的測定方法未見報道。因此，本研究采用高效液相色譜法建立竹葉柴胡中柴胡皂苷a、d 的定量測定方法，并對不同產(chǎn)地的竹葉柴胡中的柴胡皂苷a、d 進行測定，為建立竹葉柴胡的質(zhì)量標準提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀(LC-20AT、檢測器SPD-20A，日本島津公司)、Agilent C18色譜柱(150 mm× 4.6 mm，5 μm)、全自動電子天平(AUW220D，蘇州島津公司)、超聲波清洗器(HS10260D，天津恒奧公司)、遠紅外快速干燥箱(YHG-600-S-Ⅱ，上海賀德公司)。

1.2 試劑 氨水、甲醇、無水乙醇為分析純，乙腈、甲醇為色譜純，水為純凈水。

1.3 對照品 柴胡皂苷a (批號110777-200507)、柴胡皂苷d (批號110778-200506)對照品，均購自中國藥品生物制品檢定所。

1.4 藥材 竹葉柴胡藥材購自貴州興義、四川綿陽、重慶等地，經(jīng)我院生藥教研室魏升華副教授鑒定為傘形科植物膜緣柴胡Bupleurum marginatum Wall. ex DC. 的干燥根及全草。本次研究的樣品均為全草。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應性試驗 Agilent C18色譜柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相為乙腈(A)-水(B)，進行梯度洗脫(0 ～2 min，70% ～67%B;2 ～10 min，67%B;10 ～30 min，67% ～64%B;30 ～63 min，64% ～60% B);檢測波長204 nm;柱溫40 ℃;體積流量1.0 mL/min;進樣量10 μL。理論塔板數(shù)不低于3000。對照品及樣品色譜圖見圖1。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取柴胡皂苷a、d對照品適量，加甲醇溶解，制成含柴胡皂苷a、d分別為0.294、0.182 mg/mL 的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取干燥至恒定質(zhì)量的竹葉柴胡樣品粉末(過40 目篩)0.5 g，加8%氨水甲醇25 mL，超聲提取60 min，過濾，殘渣用甲醇20 mL 分2 次洗滌，合并濾液，濾液于60 ℃水浴上揮干，用色譜甲醇溶解并定容至5 mL量瓶中，用0.45 μm 的微孔濾膜濾過，即得。

圖1 對照品(A)和供試品(B)的液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of reference substances (A)and Bupleurum marginatum (B)

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取柴胡皂苷a、d對 照 品 溶 液 0.5、2.5、5、7.5、10、12.5、15 μL，按“2.1”項下色譜條件測定峰面積，分別以柴胡皂苷a、d 的進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得柴胡皂苷a 線性回歸方程為y=453 980.8x+7 307.75，r =0.999 9，表明柴胡皂苷a 的進樣量在0.147 ～4.41 μg 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系;得柴胡皂苷d 線性回歸方程為y=665 526x-20 788，r =0.999 7，表明柴胡皂苷d 的進樣量在0.091 ～2.73 μg 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗 精密稱取干燥至恒定質(zhì)量的貴州興義產(chǎn)竹葉柴胡炮制樣品粉末0.5 g，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次。結(jié)果柴胡皂苷a、d 峰面積的RSD 分別為2.5%、2.7%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取干燥至恒定質(zhì)量的貴州興義產(chǎn)竹葉柴胡炮制樣品粉末約0.5 g，精密稱定，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h 進行測定，結(jié)果柴胡皂苷a、d 峰面積的RSD 分別為2.3%、2.9%，表明供試品溶液于室溫下24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復性試驗 取干燥至恒重的貴州興義產(chǎn)竹葉柴胡炮制樣品粉末6 份，每份約0.5 g，精密稱定，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，結(jié)果柴胡皂苷a、d 的RSD 分別為2.9%、2.5%，表明方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取已知含有量的貴州興義產(chǎn)竹葉柴胡炮制樣品粉末6 份，每份約0.25 g，精密稱定，分別精密加入柴胡皂苷a、d 對照品適量，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗測定結(jié)果(n=6)Tab.1 Results of recovery tests (n=6)

2.9 樣品測定 按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別對10 個不同產(chǎn)地的竹葉柴胡中柴胡皂苷a、d 進行測定。結(jié)果見表2。

表2 樣品中柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 的測定結(jié)果(n=3)Tab.2 Components of saikoside a and saikoside d in Bupleurum marginatum (n=3)

3 討論

實驗分別對甲醇、乙醇、乙腈、5% 氨水-甲醇、7%氨水-甲醇、9%氨水-甲醇進行提取溶劑考察，結(jié)果以7%氨水-甲醇提取時皂苷含有量最高，因此在正交試驗中，分別選用6%氨水-甲醇、7%氨水-甲醇、8%氨水-甲醇進行實驗，由分析可得，3 種提取溶劑沒有差異性，因此最終優(yōu)選出8%氨水-甲醇為最佳提取溶劑。實驗對索氏提取法、回流提取法、超聲提取法進行提取方法的比較，由單因素考察實驗可得出，索氏提取3 h 與超聲提取1 h或者回流2 h 效果相同，而且3 種提取方法沒有差異性，考慮到提取方法的方便性與實驗操作的簡單性，因此采用超聲提取法進行提取。在正交試驗中，考察超聲提取時間分別為40、60、80 min，由分析可得，三者之間沒有明顯的差異性，為了實驗的操作方便性，所以采用60 min 為最佳提取時間。由于柴胡皂苷a、d 在提取過程中易受植物體中酚類或酸性成分的影響，致使環(huán)氧醚鍵開環(huán)，轉(zhuǎn)化為柴胡皂苷b1及柴胡皂苷b2，因而通常采用弱堿性溶劑提取［16］。

通過對10 個不同產(chǎn)地竹葉柴胡生品中柴胡皂苷a、d 測定可以看出，柴胡皂苷a 的平均含有量為0.12%，柴胡皂苷d 的平均含有量為0.07%，其中云南兩個產(chǎn)地竹葉柴胡含有量較高，尤以云南祿豐產(chǎn)的含有量最高，而四川三個產(chǎn)地的竹葉柴胡含有量相對較低，造成含有量差異的原因是否與生長環(huán)境、氣候、采收季節(jié)、加工方法等因素有關(guān)，有待進一步研究。

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