玉米黃素轉化為蝦青素的工藝參數研究

王嚴飛 ，劉燕青，陶正國，陳小兵，陳 佳，余 勃，陸 豫*

1南昌大學中德聯合研究院，南昌 330047;2 南昌大學藥學系，南昌 330006;3 廣州立達爾生物科技有限公司，廣州 510530

蝦青素和玉米黃素是兩個非常重要的類胡蘿卜素，其抗氧化、抗癌、防治心血管疾病、增強機體免疫等生物活性受到人們越來越多的關注［1］。蝦青素是在鳥類和魚類中發現的，包括蝦、蝲蛄、蟹和龍蝦在內的大多數甲殼類動物由于蝦青素在體內的聚集而呈現紅色。野生鮭魚同樣是由于蝦青素的作用而呈現粉紅色。由于水產養殖業中缺乏天然食用色素來源，蝦青素可以用來使水產品呈現出消費者所想要的粉紅色。研究發現蝦青素不僅是魚類著色及正常生長和健康必不可少的，也可用于養禽業來增加蛋黃的色澤［2，3］。蝦青素在某些植物和藻類中也有發現。事實上，動物本身并不能合成蝦青素，而是藻類和植物為它們提供這種類胡蘿卜素來源［4，5］。隨著蝦青素在食品、化妝品和飼料中的應用越來越廣泛，具有天然構型的蝦青素的工業化生產具有巨大的市場［6］。本課題組在研究由天然葉黃素轉化為玉米黃素的時候發現，可以直接通過一步氧化玉米黃素得到蝦青素，由于原料玉米黃素保持了葉黃素的天然手性結構，所以通過氧化玉米黃素得到的蝦青素也保持了這一天然手性［7］。而具有天然手性結構的蝦青素和非天然手性結構的蝦青素在體內的代謝過程是不一樣的，后續本課題組將繼續研究所得到的保持有天然手性的蝦青素在動物體內的生物效價的評估。

由玉米黃素轉化為蝦青素的研究方面報道比較少，其中Ribera Ruiz 等［8］人以次氯酸鈉為氧化劑，4-乙酰胺-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧為催化劑得到蝦青素。青島大學的鹿林［9］也以玉米黃素氧化為蝦青素，但是產率都較低。本文對實驗中的影響因素進行了優化，以期提高轉化率，提高工業效應。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

儀器:78-1 型恒溫磁力攪拌器(上海南匯電器廠);LC-15C 型高效液相色譜儀(日本島津，SPD-15C 紫外-可見光檢測器);RV05-ST 型旋轉蒸發儀(JANKE＆KUUNKEL 實驗儀器公司);ZQ400 型質譜儀(美國Wasters 公司，質譜條件:毛細管電壓3.00 KV，錐孔電壓30 V，提取電壓3 V，離子源溫度110℃，脫溶劑氣溫度350 ℃，脫溶劑氣流度250 L/h，錐孔氣流量50 L/h，正離子模式電噴霧質譜分析)。

試劑:玉米黃素(本課題組合成);全反式蝦青素標準品(化學合成，廣州智特奇生物科技有限公司提供);2，6-二叔丁基對甲酚、三氯甲烷、溴酸鈉、次氯酸鈉、過氧化氫、過氧乙酸、二氧化錳、硫代硫酸鈉、碘、甲醇、二氯甲烷、丙酮、二甲基亞砜均為分析純。

1.2 色譜分析條件

色譜柱:Hypersil BOS C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=70∶25∶5;檢測波長:481 nm;流速:1 mL/min;進樣量:20 μL;柱溫:室溫。

1.3 實驗步驟

在通有氮氣保護的三口瓶中加入20 mL 溶劑和0.5 g 玉米黃素(由本課題組從天然提取的葉黃素制取，下同)，待玉米黃素完全溶解后，分別加入用氫氧化鈉調好pH 值的氧化劑溶液。取少量的碘溶于10 mL 溶劑后加入燒瓶中，一定溫度下，劇烈攪拌反應一段時間。加入少量2，6-叔丁基對甲酚，飽和硫代硫酸鈉溶液洗三次，再純水洗三次，除去溶劑，HPLC 檢測。

經初步實驗和本實驗室多年來對類胡蘿卜素研究積累經驗以及文獻［8-10］報道，首先對溶劑和氧化劑的種類進行了初步篩選。然后對溶劑量、氧化劑量、pH 值、反應溫度、反應時間五個因素進行了優化。

1.3.1 溶劑對轉化率的影響

在氮氣保護的100 mL 三口燒瓶中分別加入20 mL 二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、甲醇和二甲亞砜，將0.5 g 玉米黃素溶解于溶劑中，分別加入3 g 用氫氧化鈉調pH 值為9.5 的溴酸鈉溶液10 mL。取少量的碘溶于10 mL 三氯甲烷后加入燒瓶中，一定溫度下，劇烈攪拌反應一段時間。加入少量2，6-二叔丁基對甲酚，飽和硫代硫酸鈉溶液洗三次，再純水洗三次，除去溶劑，HPLC 檢測按面積歸一化方法計算含量。

1.3.2 氧化劑對轉化率的影響

玉米黃素經氧化劑氧化即可得到蝦青素，本文就對氧化劑進行了篩選。在氮氣保護下，在三口瓶中加入20 mL 三氯甲烷和0.5 g 玉米黃素，待玉米黃素完全溶解后，分別加入調好pH 值的氧化劑溴酸鈉、次氯酸鈉、二氧化錳、過氧化氫和過氧乙酸。取少量的催化劑溶于10 mL 三氯甲烷后加入燒瓶中，一定溫度下，劇烈攪拌反應一段時間。加入少量2，6-二叔丁基對甲酚，飽和硫代硫酸鈉溶液洗三次，再純水洗三次，除去溶劑，HPLC 跟蹤監測。

1.3.3 pH 值對轉化率的影響

在氮氣保護的100 mL 三口燒瓶中加入20 mL三氯甲烷和0.5 g 玉米黃素，待玉米黃素完全溶解后，分別加入pH 值為3.5、4.5、5.5、7、8.5、9.5、10.5 的溴酸鈉，取少量碘溶于10 mL 三氯甲烷后加入反應液中。一定溫度下，劇烈攪拌，反應一段時間。加入少量2，6-二叔丁基對甲酚，飽和硫代硫酸鈉溶液洗三次，再純水洗三次，除去溶劑，HPLC 檢測。

1.3.4 溫度對轉化率的影響

在氮氣保護的100 mL 三口燒瓶中加入20 mL三氯甲烷和0.5 g 玉米黃素，待玉米黃素完全溶解后，加入3 g pH 為9.5 的溴酸鈉，取少量碘溶于10 mL 三氯甲烷后加入反應液中。分別設定溫度為10、15、20、25、30、35、40 ℃，劇烈攪拌，反應一段時間。加入少量2，6-二叔丁基對甲酚，飽和硫代硫酸鈉溶液洗三次，再純水洗三次，除去溶劑，HPLC 檢測。

1.3.5 反應時間對轉化率的影響

在氮氣保護的100 mL 三口燒瓶中加入20 mL三氯甲烷和0.5 g 玉米黃素，待玉米黃素完全溶解后，加入3 g pH 為9.5 的溴酸鈉，取少量碘溶于10 mL 三氯甲烷后加入反應液中，30 ℃下劇烈攪拌反應3、6、9、12、15、18、21 h。加入少量2，6-二叔丁基對甲酚，飽和硫代硫酸鈉溶液洗三次，再純水洗三次，除去溶劑，HPLC 檢測。

1.3.6 三氯甲烷用量對轉化率的影響

在氮氣保護的100 mL 三口燒瓶中分別用三氯甲烷/玉米黃素(v/m)10、20、30、40 和50 用量的三氯甲烷，將0.5 g 玉米黃素溶解于三氯甲烷中，加入3 g pH 值為9.5 的溴酸鈉溶液10 mL，取少量碘溶于10 mL 三氯甲烷后加入反應液中。一定溫度下，劇烈攪拌，反應一段時間。加入少量2，6-二叔丁基對甲酚，飽和硫代硫酸鈉溶液洗三次，再純水洗三次，除去溶劑，HPLC 檢測。

1.3.7 溴化鈉用量對轉化率的影響

在氮氣保護的100 mL 三口燒瓶中加入20 mL三氯甲烷和0.5 g 玉米黃素，待玉米黃素完全溶解后，分別加入溴酸鈉/玉米黃素3、4.5、6、7.5、9 當量比的pH 值為9.5 的溴酸鈉，取少量碘溶于10 mL三氯甲烷后加入反應液中。一定溫度下，劇烈攪拌，反應一段時間。加入少量2，6-二叔丁基對甲酚，飽和硫代硫酸鈉溶液洗三次，再純水洗三次，除去溶劑，HPLC 檢測。

2 結果與討論

2.1 溶劑對轉化率的影響

5 種溶劑所得實驗結果如表1 所示。

表1 不同溶劑對蝦青素含量的影響Table 1 The effect of different solvents on the content of astaxanthin

從表1 中可以看出，二氯甲烷和三氯甲烷作為溶劑時，蝦青素含量較高。丙酮、甲醇和二甲亞砜中沒有明顯反應，這是因為它們能與氧化劑溶液中的水混溶，玉米黃素析出，反應不進行。二氯甲烷沸點太低，不宜在升溫和長時間條件下作為反應溶劑，所以選擇三氯甲烷為反應溶劑。

2.2 最佳氧化劑的選擇

5 種氧化劑所得結果如表2 所示。

表2 不同氧化劑對蝦青素含量的影響Table 2 The effect of different oxidants on the content of astaxanthin

從表2 中可以看出溴酸鈉和次氯酸鈉可以較好的將玉米黃質氧化為蝦青素，次氯酸鈉反應時間稍長或稍過量玉米黃素都將很快被破壞，不易控制，溴酸鈉則不會，相比較溴酸鈉更好;二氧化錳和過氧化氫作氧化劑時沒有明顯反應;而過氧乙酸氧化性太強，直接將玉米黃質破壞。所以選取溴酸鈉作為玉米黃素氧化為蝦青素的氧化劑。

2.3 pH 值對轉化率的影響

圖1 pH 值對蝦青素含量的影響Fig.1 Effect of the pH value on the content of astaxanthin

由圖1 可以看出隨著反應體系pH 值的增大，蝦青素含量相應增加，當pH 值達到9.5 時，蝦青素含量達到最大值，堿性有利于玉米黃質轉化為蝦青素，但堿性過強會破壞蝦青素雙鍵結構。所以反應體系PH 值優化為9.5。

2.4 溫度對轉化率的影響

圖2 溫度對蝦青素含量的影響Fig.2 Effect of the temperature on the content of astaxanthin

由圖2 可以看出溫度對蝦青素含量的影響較大，低溫不利于玉米黃質向蝦青素的轉化，溫度過高使蝦青素氧化破壞。所以最佳反應溫度優選為30 ℃。

2.5 反應時間對轉化率的影響

圖3 反應時間對蝦青素含量的影響Fig.3 Effect of the reaction time on the content of astaxanthin

由圖3 可以看出隨著反應時間的延長，蝦青素的含量先增加，隨后下降，在12h 時蝦青素含量達到最大值，所以，反應時間選取為12h。

2.6 三氯甲烷用量對轉化率的影響

圖4 三氯甲烷量對蝦青素含量的影響Fig.4 Effect of the trichloromethane on the content of astaxanthin

從圖4 可以看出，三氯甲烷/玉米黃素為40 時蝦青素含量最高，隨三氯甲烷用量的增加，蝦青素含量開始下降，所以三氯甲烷/玉米黃素選擇為40。

2.7 溴酸鈉用量對轉化率的影響

圖5 氧化劑量對蝦青素含量的影響Fig.5 Effect of the oxidant on the content of astaxanthin

從圖5 中可以看出隨著氧化劑量的增加，蝦青素含量逐漸增加，但當溴酸鈉/玉米黃素達到6 以后，蝦青素開始部分被氧化，含量開始下降。所以溴酸鈉/玉米黃素最佳區間為5～7，優選為6。

2.8 蝦青素的表征

經實驗對反應條件進行優化，以三氯甲烷為溶劑，溴酸鈉為氧化劑，當三氯甲烷用量為20 mL，溴酸鈉的用量為3 g，pH 為9.5，反應溫度為30 ℃，反應時間為12 h，得到的蝦青素粗品經HPLC 檢測按面積歸一化法計算其蝦青素含量達到69%。從圖6可以看出在t=11.10 min 和t=13.13 min 有2 個主峰，這兩個主峰分子離子峰均為597，與蝦青素的相對分子質量相符。從圖7 的紅外譜圖可以看出，在1630.43 和1524.90 出現了2 個羰基伸縮振動的特征吸收，3302.02 有羥基的特征吸收，進一步證明了我們得到了蝦青素。我們對這2 個主峰進行分離提純并做了核磁共振鑒定，并與全反式蝦青素標準品進行了對照，發現1 號峰是全反式蝦青素，那么2 號峰就是一個順式蝦青素。由于一維的核磁共振譜圖無法判斷出順式蝦青素的具體位置，后續我們將通過二維核磁共振確定順式蝦青素的結構。

圖6 蝦青素HPLC-MS 總離子流圖(A)以及保留時間11.10 min(B)和13.13 min(C)的質譜圖Fig.6 Tatal ion chromatogram of astaxanthin prepared under the optimized oxidization condizations(A)and mass spectra at retention times 11.10 min(B)and 13.13 min(C)

全反式蝦青素:1H NMR(CDCl3，600 MHz)δ:6.58(3H)，6.44(3H)，6.30(6H)，4.33(2H)，2.16(2H)，1.99(10H)，1.94(7H)，1.81(6H)，1.32(7H)，1.21(6H)。

ESI-MS m/z(%):597(［M+H］+，85)

順式蝦青素:1H NMR(CDCl3，600 MHz)δ:6.65(3H)，6.46(3H)，6.22(6H)，4.32(1H)，4.02(1H)，1.98(13H)，1.73(3H)，1.32(11H)，1.25(4H)，1.07(7H).

圖7 蝦青素紅外譜圖Fig.7 IR spectrum of astaxanthin

ESI-MS m/z(%):597(［M+H］+，20)

3 結論

本論文以本實驗室制備的玉米黃素為原料，在溴酸鈉氧化下得到附加值更高的蝦青素。并優化了影響氧化的因素，得出最佳反應條件:三氯甲烷為溶劑，用量為20 mL，溴酸鈉為氧化劑，用量為3 g，pH值為9.5，于30 ℃下反應12 h，蝦青素含量達69%。

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