白藜蘆醇預處理對束縛應激大鼠胃潰瘍的保護作用

張 紅，問慧娟，周雅靜，姜源濤

1河北大學附屬醫院;2 河北大學基礎醫學院，保定 071000

應激性胃潰瘍是臨床危重疾病的常見并發癥，在重癥監護室(ICU)的發生率可高達75%～100%，其發生機制尚未完全闡明，但越來越多的研究顯示，氧化應激在應激胃黏膜損傷中發揮著重要作用，調節或干擾氧化應激以及氧化與抗氧化之間的平衡是胃腸道粘膜細胞保護的一個重要方面。白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種天然抗氧化劑，廣泛存在于21 科31 屬72 種植物中，其中葡萄、虎杖、花生、桑葚等常見植物中含量較高。近年來的研究表明，Res具有清除自由基、抗炎、抑制血小板聚集、舒張血管等多方面藥理學作用，目前主要應用于心血管保護、衰老、腫瘤預防等方面。Res 對應激引起的急性胃粘膜損傷的作用尚未見報道，本實驗以大鼠水浸-束縛應激(WRS)為模型，探討Res 對應激性胃潰瘍的保護作用，并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

白藜蘆醇(美國Amresco 公司)。NOS 試劑盒、NO 試劑盒、考馬斯亮藍蛋白測試試劑盒(均由南京建成生物工程研究所提供)。Stat-Fax-2100 酶標儀(美國Awareness 公司);TDL-5-A 低速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠);XW-80A 型渦旋混勻器(上海滬西分析儀器廠);SHA-BA 型雙功能水浴恒溫振蕩器(金壇市杰瑞爾電器有限公司)。

1.2 模型制作與分組

Wistar 大鼠(河北醫科大學實驗動物中心提供)30 只，雌雄各半，體重220～300 g，隨機分為正常對照組(NG)、應激組(MG)、白藜蘆醇低劑量組(LDG)、中劑量組(MDG)和高劑量組(HDG)。白藜蘆醇各處理組以白藜蘆醇分別按30、60、120 mg/kg灌胃3 d，NG 組和MG 組灌服同等容量的生理鹽水。末次給藥后，參照Cui 等人［1］的方法建立WRS 模型，8 h 后將動物用戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，剖腹，游離出胃。

1.3 胃酸測定

抽取胃液，pH 計測定胃液pH 值。

1.4 胃潰瘍指數測定

結扎賁門、幽門端，用10 mL 生理鹽水充灌，置于0.5%福爾馬林溶液中固定5 min，沿胃大彎剪開，漂洗，用濾紙吸干水分，展平，觀察潰瘍形成情況，按改良Guth 標準［1］計算潰瘍指數:病變的最大徑＜1 mm 為1 分;1～2 mm 為2 分;2～3 mm 為3分;3～4 mm 為4 分;將＞4 mm 者分成若干段，每段按上法計分，若病灶寬于2 mm，其長度乘以2。全胃各病灶評分之和作為潰瘍指數(Ulcer Index，UI)。

1.5 胃組織MDA、SOD 活性測定

留取潰瘍明顯處的胃粘膜組織約0.3 g，加9 倍的生理鹽水，制備成10% 的組織勻漿，4 ℃3000 rpm 離心10 min，取上清液待測。各取50 μL 胃組織勻漿上清液，按試劑盒說明書進行操作。組織蛋白含量用考馬斯亮蘭法測定。

1.6 統計學分析

2 實驗結果

2.1 形態學觀察

正常大鼠胃黏膜表面光滑，未見水腫及出血點;WRS 各組大鼠胃腔內含大量咖啡樣物質，沖洗后可見胃粘膜表面部分脫落，可見廣泛分布、呈條索狀或點狀的深褐色潰瘍面和出血點，潰瘍周圍呈彌漫性水腫，以應激組最為明顯;Res 各組胃黏膜水腫、潰瘍面及出血點均有不同程度減輕，以中劑量組作用顯著。結果見圖1。

圖1 各組大鼠胃體部的形態學圖片Fig.1 Gastric morphologic images of different groups

2.2 胃潰瘍指數(UI)的變化

與對照組比較，應激組UI 顯著升高(P ＜0.01);與應激組比較，Res 各組UI 顯著降低(均P＜0.01)，以中劑量組作用顯著，其中低、高劑量組與中劑量組比具均有顯著差異(均P ＜0.01)，說明Res 可抑制胃潰瘍產生，并具有一定的劑量依賴性;對照組UI 為0，見表1。

表1 白藜蘆醇對WRS 模型胃潰瘍指數、胃液pH、胃組織SOD、MDA 的影響(，n=6)Table 1 Effect of resveratrol on Ulceration Index，pH of gastric juice，SOD and MDA(，n=6)

表1 白藜蘆醇對WRS 模型胃潰瘍指數、胃液pH、胃組織SOD、MDA 的影響(，n=6)Table 1 Effect of resveratrol on Ulceration Index，pH of gastric juice，SOD and MDA(，n=6)

注:與對照組比較，＊＊P ＜0.01;與應激組比較，#P ＜0.05，## P ＜0.01;與中劑量組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。Note:Compare with control，＊＊P ＜0.01;Compare with model，#P ＜0.05，## P ＜0.01;Compare with middle dose Res group，△P ＜0.05，△△P ＜0.01.

2.3 胃液pH 的變化

應激組大鼠胃液pH 明顯低于對照組(P ＜0.01)，Res 各處理組均使pH 升高(P ＜0.05 或P ＜0.01)，但各劑量組之間沒有顯著差異，見表1。

2.4 胃粘膜組織SOD、MDA 活性的變化

應激組大鼠SOD 活性明顯降低，MDA 含量明顯升高，與對照組相比改變均有顯著性差異(均P ＜0.01);Res 各組使這些指標均發生了相反變化(P ＜0.05 或P ＜0.01)，以中劑量組作用顯著;其中低劑量組與中劑量組比有顯著差異(P ＜0.05 或P ＜0.01)。見表1。

3 討論

氧自由基通過脂質過氧化反應引起細胞膜、細胞器膜破壞，而且可與蛋白質巰基或色氨酸殘基反應，導致蛋白質功能或酶活性喪失，引起細胞廣泛的損傷。超氧陰離子()是生物體內最先形成、最主要的氧自由基，可被體內抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)及時清除。氧化和抗氧化平衡失調是許多疾病發生、發展的一種最基本、最普遍的危險因素。應激性胃潰瘍的發病機制尚未完全闡明，目前普遍認為在應激性胃粘膜損傷中氧自由基是一個早期的、獨立的致損傷因素而備受關注［2］。本實驗結果也顯示，應激刺激導致MDA 含量明顯升高、SOD 活性顯著降低。因此胃粘膜氧自由基產生和清除失衡是造成胃粘膜的損傷重要機制之一。

大量的研究發現許多中草藥表現出了很好的抗潰瘍作用，其突出機制是他們的抗氧化活性或清除活性氧簇(ROS)的能力。Res 是一種天然多酚類物質，具有很強的抗氧化性。Roghani 等發現1～100 μmol/L 的Res 能有效抑制細胞內外氧自由基的產生［3］;Leonard 等證實Res 是一個有效的羥基、超氧化物和金屬誘導基團的清除劑，并對活性氧引起的細胞膜脂質過氧化和DNA 損傷具有保護作用［4］;Holthoff 也發現Res 是一種功能性過氧亞硝基陰離子清除劑［5］。本實驗中，Res 預處理后明顯減輕了WRS 大鼠胃黏膜的水腫、出血和潰瘍面積，潰瘍指數也顯著降低，顯示出Res 對應激性胃潰瘍有明確的保護作用;Res 使胃粘膜組織SOD 的活性顯著升高，MDA 含量降低，提示Res 通過減少氧自由基產生和增加其清除而抑制胃粘膜損傷，發揮了其抗氧化特性。實驗中還發現Res 的抗潰瘍作用以中劑量組顯著，低劑量組也顯示出改善胃潰瘍的藥效，但高劑量組作用反而減弱，可能與劑量過大而增加藥物毒性作用有關，Dey 報道白藜蘆醇在較高劑量加重潰瘍［6］。

胃酸在應激性潰瘍形成中的作用長期以來一直存在爭議，現代普遍認為胃酸不是應激性潰瘍發病的主要因素，但是胃酸的存在會加重胃粘膜損傷，促進潰瘍發生。本研究顯示束縛應激引起胃液pH 明顯降低，Res 使胃液pH 升高，在一定程度上防止了胃潰瘍的發生或加重。Res 提高胃液pH 的機制目前尚不清楚，賈一韜發現在束縛應激早期即有NFκB 信號通路的活化［7］，IL-lβ、IL-6 等細胞因子釋放增加，強烈刺激下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸(HPA)軸，使胃酸和胃蛋白酶分泌增多［8，9］，Res 可激活SIRT-1，抑制NF-κ 信號通路，下調TNF-α、IL-lβ、IL-6 表達，因而抑制胃酸分泌［10］。有研究發現NO 是胃酸分泌的內源性抑制劑［11］，Res 可提高eNOS 活性，增加NO 合成［12］，因而能抑制胃酸分泌，提高胃液pH。其具體機制有待進一步研究。

中藥的藥物作用通常被認為是更安全的傳統療法的替代，Res 通過其強抗氧化活性及抑制胃酸分泌而預防應激性胃粘膜的損傷。因此，Res 有望成為一種新型黏膜保護劑。

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