雞骨草黃酮體外抗活性氧自由基作用的研究

史柳芝，史恒芝，黃鎖義，李 容

1右江民族醫學院 醫學檢驗學院，百色 533000;2湖南省郴州市第一人民醫院，郴州 423000;3右江民族醫學院 藥學院，百色 533000

黃酮類(flavontes)化合物是植物光合作用產生的一大類化合物，其藥用價值很高，具有抗癌、抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抗炎鎮痛、免疫調節、降血糖、治療骨質疏松、抑菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗輻射等作用［1］。現代研究表明［2，3］，由于氧化損傷的機制在疾病的發生發展中起著重要的作用，因此，中藥的抗氧化作用是其達到治療效果的重要因素。很多疾病包括腫瘤、心腦血管疾病、老年癡呆等都不同程度地與自由基損傷有關。而黃酮類化合物是自然界中抗氧化作用最強的一類天然化合物，由于它具有很強的抑制活性氧、清除自由基作用，同時毒副作用相對小于化學合成藥，因此黃酮類化合物一直是人們致力于尋找新藥的重要研究領域。

雞骨草Abrus cantoniensis，又名廣州相思子、土甘草，為豆科相思子屬植物雞骨革去除莢果后的干燥全草，主要分布于廣東、廣西、福建及海南等地區。具有清熱解毒，疏肝止痛之功效，是臨床常用中藥，廣泛用于黃疸，脅肋不舒，胃脘脹痛，急、慢性肝炎［4］。雞骨草是治療急、慢性肝炎和肝硬化腹水較為理想的藥材［5］。目前，對雞骨草黃酮抗氧化研究鮮見報道，故本文對雞骨草黃酮體外抗活性氧自由基作用進行了研究，旨在為開發利用雞骨草黃酮資源提供科學依據。

1 材料與試劑

1.1 材料

1.1.1 原料

新鮮雞骨草，經右江民族醫學院民族醫教研室覃道光副教授鑒定，樣品標本存放在中藥化學實驗室(購自廣西百色市右江區藥店)。

1.1.2 試劑

無水乙醇，95%乙醇，丙酮，乙醚，苯酚，濃硫酸等均為國產分析純，葡萄糖標準品(J＆KCHEMICAL LTD)。

1.1.3 儀器設備

KQ5200DB 型數控超聲波清洗器(超聲工作頻率40 Hz，昆山市超聲儀器有限公司);722N 型光柵分光光度計(上海精密儀器有限公司);TG3288.電子天平(上海天平儀器廠);SHB-III 循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司);HHsyzL-Ni6-C電熱恒溫水浴鍋(北京長源實驗設備廠)。

2 方法與結果

2.1 樣品的準備

2.1.1 樣品提取純化方法

準確稱取雞骨草10 g，烘干、粉碎。稱取雞骨草粉末約6 g，加80 mL95%乙醇，超聲波提取2.5 h，抽濾。濾渣再加80 mL95%乙醇，超聲波提取2.5 h，抽濾，合并兩次濾液，減壓回收乙醇至濾液僅剩25 mL 左右為止，放置250 mL 容量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度，得到雞骨草黃酮提取液。

2.1.2 黃酮的含量測定

已經有文獻雞骨草黃酮進行了含量測定［6］:分別精密吸取黃酮提取液0.5 mL 于10.00 mL 容量瓶中，分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.30 mL，搖勻，靜置6 min;再加10%硝酸鋁溶液0.30 mL，搖勻，靜置6 min;再加4%氫氧化鈉溶液4.00 mL，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置12 min，以試劑空白作參比液，于500 nm 處測吸光度A。，根據回歸方程:A=13.5184C-0.0311，計算樣品中總黃酮的含量ρ=0.3063 mg/mL。

2.2 黃酮提取物清除DPPH 自由基能力

DPPH 是一種穩定的自由基，與抗氧化劑發生反應，提供H 被還原，顏色發生變化，由深紫色變為淡黃色，可以用紫外可見分光度法定量測定。取0.5 mL 新配置的DPPH 溶液［c(DPPH)=6 ×10-4mol/L］置于10 mL 的具塞比色管中，然后加入不同體積的樣品溶液，無水乙醇定容至5 mL，室溫暗光下反應30 min，以無水乙醇調零，在517 nm 處測定其吸光度A。以高濃度逐漸稀釋的方式檢測不同濃度樣品對自由基的清除率，以自由基清除率為50%時樣品的濃度(IC50)來衡量樣品對自由基的清除能力。IC50越小，表明樣品清除自由基的能力越強。其清除率計算公式:

其中A1為反應時間t=0 min 時空白吸光度，A2為反應時間t=30 min 時的吸光度。

以實驗提取液總黃酮作為樣品用無水乙醇定容至5 mL 分別測其對DPPH 自由基清除的作用，由圖1 可以看出，隨著黃酮濃度的增加，對DPPH 的清除作用增大，自由基清除率為50% 時樣品的濃度(IC50)為0.228 mg/mL，濃度較小，表明雞骨草黃酮清除DPPH 自由基的能力較顯著。

圖1 DPPH 自由基清除率Fig.1 DPPH free radicals clearance

2.3 黃酮提取物清除超氧自由基能力

采用鄰苯三酚自氧化法［7］進行測定。具體方法如下:取0.5 mol/L、pH8.2 的Tris-HCl 緩沖液4.0 mL 于干燥具塞比色管中，置于25 ℃水浴中預熱20 min，分別加入不同濃度的待測品0.2 mL，后均加入2.5 mmol/L 鄰苯三酚(由10 mmol/L HCl 制)0.8 mL，混勻后25 ℃水浴中準確反應4 min，立即加入10 mmol/L HCl 2 滴終止反應，蒸餾水調零，在320 nm 處測定吸光度A。其清除率計算公式:

其中A0:為加鄰苯三酚但不加樣品時的吸光度;A1:為加樣品和鄰苯三酚時的吸光度;A2:為加樣品不加鄰苯三酚時的吸光度。

圖2 超氧自由基清除率Fig.2 The clearance rate of superoxide redical

2.4 還原Fe3+能力

采用普魯士蘭法［7］測定樣品還原Fe3+能力。在系列10 mL 具塞比色管中依次加入不同濃度的樣品溶液2.5 mL，2.5 mL 磷酸鹽緩沖液［C(磷酸鹽緩沖液)=0.2 mol/L pH6.6］和2.5ml 鐵氰化鉀(1%)，混勻后置于50 ℃水浴中反應20 min，然后加入2.5 mL 三氯乙酸(10%)，混勻后將溶液渾濁離心(3000 rpm)10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL 蒸餾水和0.5 mL(0.1%)三氯化鐵溶液，混勻，以試劑空白作參比，在700 nm 處測定吸光度值，吸光度值增加表明還原能力增強。

由表1 可以看出，隨著黃酮濃度增大，其吸光度值增加，對Fe3+還原能力增強。

表1 還原Fe3+能力吸光度值Table 1 Absorbency value of evident reduction energy

3 結論

近年來，世界上掀起了植物藥開發的熱潮，植物藥以其天然低毒的特點備受青睞，而黃酮類化合物以其光譜的藥理作用引人矚目。雞骨草的來源廣泛，因此，本文的研究結果為進一步深入研究雞骨草的藥理活性及其深入開發奠定基礎。

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5 Zhu Q(朱奇)，Chen Y(陳彥).The development device and present studies of biological nitrogen fixation in Chinese agricultural production.J Microbiol(微生物學雜志)，2003，23:40-43.

6 Zhang LD(張麗丹)，Luo JH(羅建華)，Meng CY(蒙春越)，et al.Extracting total flavone from Abrus cantoniensis and the effect of its extract on scavenging of hydroxyl radicals.Studies of Trace Elements and Health(微量元素與健康研究)，2007，24:44-45.

7 Wen ZJ(溫昭君)，He YP(何燕平)，Wu WL(吳韋柳)，et al.The antioxidant effect of flavonoid of caudexes of Jasminum sam bac.Lishizhen Med Mater Med Res(時珍國醫藥)，2012，23:1866-1867.