五爪龍外敷液中芹菜素與槲皮素的HPLC 測定

董愛文，朱春艷，卓 琦

1吉首大學林產化工工程湖南省重點實驗室，張家界 427000;2吉首大學生物資源與環境科學學院，湖南吉首 416000;3 吉首大學城鄉資源與規劃學院，張家界 427000

五爪龍(Potentilla kleiniana Wight et Arn.)(蛇含委陵菜)是委陵菜屬植物［1］。常以全草入藥，性味:苦，微寒。具有清熱解毒、止咳止痢、截瘧、解毒活血等功效，常用于治療咽喉腫痛、小兒驚風、百日咳、急慢性胃炎等療效顯著［2］。武陵山區中醫用五爪龍等草藥用適量白酒搗爛后的醇浸液或水煎煮的湯液來外敷治療瘡毒、痛腫及蛇蟲咬傷等。而兩種外敷液實際治療效果差異較大，中醫會根據病況選擇性使用何種外敷液及方中君藥五爪龍用量。參考相關文獻芹菜素具有抗氧化、抑制致癌物活性、抗炎、抗菌、抗病毒、抗焦慮、抗內毒素與免疫調節劑等作用［3，4］;而槲皮素有抗癌防癌、鎮痛、抗菌、抗病毒、抗衰老、抗炎、抗過敏、抗自由基及抗氧化等多種生物活性，且對人體無毒、無害、無致死、致癌、致畸、致突變等作用［5，6］，而委陵菜屬植物均含芹菜素、槲皮素等［7］，據此建立薄層層析分離、HPLC 法測定此外敷液中芹菜素與槲皮素的含量，并對方法學進行了考察［8］，結果表明，此法能迅速、準確測定芹菜素與槲皮素在兩外敷藥液中的含量，初步探索了民間藥的有效成分分析與檢測方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-20A 高效液相色譜儀(日本)島津;R-215 旋轉蒸發儀(瑞士)BUCHI;LD5-2A 離心機(北京醫用);HH-6 電子恒溫水浴鍋(蘇州威爾實驗用品有限公司);MHA 型數顯式恒溫電熱套(北京科偉永興儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

乙醇、磷酸、鹽酸、乙酸乙酯、石油醚、氯仿、甲酸為國產分析純，水為蒸餾水，甲醇為色譜純;薄層層析用硅膠(青島海洋化工有限公司);羧甲基纖維素鈉(湘潭市森泰化工);芹菜素標準品(購于天津尖峰天然產物研究開發有限公司，純度≥98 %);槲皮素標準品(批號:100081-200907，中國藥品生物制品鑒定所)。

五爪龍兩外敷液按張家界市永定區沙堤鄉汆水溪村田中醫提供的藥方配制。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Shim-pack VP-ODS C18(4.6 mm ×150 mm，5 μm);柱溫:30 ℃;流動相:甲醇-0.4%磷酸(50∶50，v ∶v);流速:1.0 mL/min;檢測波長:360 nm;進樣體積:10 μL。檢測液進樣前經0.45 μm 濾膜抽濾。

2.2 標準品溶液的制備

精密稱取于60 ℃減壓干燥至恒重的芹菜素與槲皮素標準品各20.00 mg，混合置于100 mL 容量瓶中，乙醇溶解并定容，得兩成分各0.2 mg/mL 的混合標準品溶液，用0.45 μm 濾膜抽濾，即得。

2.3 供試溶液的制備

A 液:按配方稱取陰干水分新鮮五爪龍(15 g)等草藥混合，加入適量50%乙醇搗碎，補充乙醇至500 mL，密封后室溫浸漬8 h，三層脫脂棉紗布過慮;B 液:按配方稱取陰干水分新鮮五爪龍(15 g)等草藥切碎、混合后加500 mL 蒸餾水，溫火煎煮至沸騰后30 min，趁熱三層脫脂棉紗布過慮;兩外敷液用4號新華濾紙抽濾，濾液再用旋轉蒸發儀濃縮至15～30 mL。濃縮液依次用石油醚，氯仿萃取去雜后各加入25%鹽酸15 mL 水浴回流水解60 min，快速冷卻，離心(10 000 rpm)10 min，取上清液，用旋轉蒸發儀濃縮至10 mL 左右，經硅膠G 薄層層析，刮取與芹菜素、槲皮素標準品相同Rf0.65 與0.53 的全部芹菜素與槲皮素斑點［9］。溶解定容至100 mL，搖勻，用0.45 μm 濾膜抽濾，即得。

2.4 標準曲線的繪制

精密移取混合標準品溶液0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mL，置于10 mL 容量瓶中，乙醇稀釋定容，搖勻，配制成各0、60、120、180、240、300 μg/mL 的混合溶液，按色譜條件分別進樣檢測［10］。以濃度(X)為橫坐標，峰面積積分值(Y)為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程:Y芹=16248X-50319，r=0.9998;Y槲=160275X-43582，r=0.9996，線性范圍為60～300 μg/mL。

2.5 精密度試驗

精密吸取混合標準品溶液10 μL，按2.1 項色譜條件連續重復進樣6 次，測定其峰面積，結果見表1，芹菜素RSD=1.641% (n=6)、槲皮素RSD=1.605%(n=6)，表明儀器精密度良好。

表1 精密度測定結果Table 1 Results of precision tests

2.6 重現性試驗

制取6 份水煎樣品溶液，按2.3 項實驗室處理后的濾液按2.1 項色譜條件測定其峰面積，結果外敷湯液中芹菜素與槲皮素平均質量分數分別為0.078%、0.106%，RSD 為1.463%、1.378% (n=6)，表明本方法的重現性較好。

2.7 穩定性研究

取2.3 項制備的兩種供試溶液，按2.1 項色譜條件，每隔6 h 進樣10 μL(3 d 測7 次)，結果乙醇外敷液RSD 為2.158%、2.085%(n=7)，而水煎液RSD 為1.836%、1.785%(n=7)，表明兩種外敷液中芹菜素與槲皮素在室溫下3 d 內較穩定。

2.8 加樣回收率試驗

同批次配制好的藥方材料12 份，各加入0.2 mg/mL 的標準品混合溶液5 mL 后按2.3 項的方法制取乙醇與水煎外敷液各6 份并處理外敷液，按2.1 項色譜條件測定，計算回收率，結果乙醇外敷液中芹菜素與槲皮素平均回收率為100.7% 與99.3%，RSD 為1.538%與1.865%(n=6)，水煎外敷液中芹菜素與槲皮素平均回收率為99.2% 與98.6%，RSD 為2.037%與2.107%(n=6)，因此本法具有較好的回收率。

圖1 標準品(A)、水煎液(B)及乙醇液(C)的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of standard(A)，water-decocted extract(B)and alcohol extract(C)

2.9 樣品測定

分別精密吸取標準品混合溶液與2.3 項的水煎液與乙醇液各10 μL，按2.1 項色譜條件進行檢測，其HPLC 檢測圖譜見圖1，以6 mL/min 與12 min 左右所出峰的峰面積進行計算，結果水煎液中芹菜素與槲皮素的質量分數為0.125%與0.131%，乙醇液中芹菜素與槲皮素的質量分數為0.316% 與0.268%。

3 討論

由于田老中醫常年在鄉間用草藥五爪龍等的乙醇液或水煎煮液外敷治療山區農民的瘡毒、痛腫及蛇蟲咬傷，其所用藥料完全一致，只是方中所用溶劑不同，而治療效果差異明顯;HPLC 檢測的結果(圖1B、C)也顯示溶劑不同外敷液中藥效成分差異較大，這與治療時乙醇液比水煎液的治療效果好是一致的，而對兩外敷液中其它藥效成分還有待進一步分析與檢測。

本實驗所用供試液完全按鄉村中醫提供的藥方和方法制備，并對外敷液中芹菜素與槲皮素進行了初步純化與薄層層析，使其達到能進行HPLC 法檢測，分離純化后的外敷液在室溫下3 d 內較穩定，這與民間一副制劑用三天，一天外敷三到五次也是一致的。

本實驗建立的方法具有操作簡便，能迅速、準確測定兩外敷藥液中芹菜素與槲皮素的含量，其精密度、重現性、回收率都較好，此為民間用藥中有效成分的分析與檢測建立了初步方法。

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