雞足葡萄黃酮類成分的分析

胡松梅，李思長，禹華芳

1湖南婁底職業技術學院，婁底 417000;2湖南九鼎科技有限公司，岳陽 414000

雞足葡萄(Vitis lanceolatifoliosa C.L)為葡萄科葡萄屬多年生木質藤本植物［1］，民間常當作一種很好的保健品飲用，是最近發現的一種新型甜味劑植物，具有較大的開發利用價值，其黃酮含量的測定國內未見報道。本文通過分光光度法，對不同產地，不同時期葉、莖總黃酮含量進行測定比較，以期得到含量最高的部位，含量最高的產地，為雞足葡萄將來更好的開發和利用奠定良好的基礎。本試驗對雞足葡萄的黃酮類成分進行了初步研究，為進一步進行其黃酮類化學成分的分離、鑒定打下良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

1.1.1 材料與主要儀器

雞足葡萄采自湖南邵陽和衡山，為春、夏嫩莖葉混合樣。鑒定者為湖南農業大學蔣道松教授，憑證樣品保存于湖南農業大學。主要儀器為UV-2100雙光束紫外可見分光光度計(北京瑞利分析儀器公司);LC-20AT 液相色譜儀(日本島津);2537A 短波紫外分析儀(上海分析儀器廠);載玻片;玻板;點樣毛細管，層析缸，層析用紙。

1.1.2 主要試劑

甲醇(FCP)、鹽酸(AR)、氫氧化鈉(AR)、鎂粉(CP)、鋅粉(CP 無鉛)、硼酸(AR)、薄層層析硅膠G，柱層析聚酰胺(80～100 目)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理

取雞足葡萄干粉500 g，75%乙醇浸泡過夜，料液比1∶10，80 ℃溶劑回流兩次，每次4 h，合并，減壓過濾回流提取液得粗提液1、2，將粗提液1 用石油醚萃取數次直至萃取液石油醚無色為止，除去脂溶色素，將水層揮發除去殘留石油醚，再用乙酸乙酷等體積萃取數次，至乙酸乙脂層色淡為止，旋轉蒸發，回流回收乙酸乙脂，得乙酸乙脂浸膏。

1.2.2 乙酸乙脂浸膏的處理

取部分粗提液的乙酸乙酷浸膏用甲醇溶解后加少許聚酰胺拌樣，揮干溶劑，上聚酰胺柱，用乙醇梯度依次洗脫，洗脫開始后，即按50 mL/份接收洗脫液，同時用檢測黃酮類物質的特征反應(HCl-MgCl2)隨時檢測流出液的情況，至第35 餾份時開始呈特征反應，以上共接受160 瓶洗脫液。

1.2.3 粗提液定性檢驗

通過紫外分析儀檢視反應、鹽酸-鋅粉反應、與金屬離子的絡合反應、四氫硼鈉反應、Molish 反應等來進行黃酮類別的確認。

1.2.4 薄層層析鑒別

1.2.4.1 薄層層析鑒別系統的選擇

使用硅膠G 薄層板(點樣量0.5 μL)，經過試驗，選定3 組展開系統，將粗提液間隔1 cm 多次點樣，待樣點充分干燥后，將硅膠薄層板直立于盛有展開劑的層析缸中，浸沒薄層板下端0.3 cm，上行展開，至展開劑上行至7.5 cm 時，取出聚酰胺薄層板，用吹風機吹干后于紫外分析儀下檢視。

1.2.4.2 不同產地總黃酮的薄層層析鑒別比較

將粗提液1(湖南衡山)、粗提液2(湖南邵陽)間隔1 cm 多次點樣(點樣量0.5 μL)，待樣點充分干燥后，將硅膠薄層板直立于盛有展開劑的層析缸中，以石油醚∶乙酸乙脂∶甲酸=3∶12∶1 為展開劑展開，浸沒硅膠薄層板下端0.3 cm，上行展開，至展開劑上行至7.5 cm 時，取出硅膠薄層板，用吹風機吹干后于紫外分析儀下檢視。

1.2.4.3 洗脫液不同餾份的薄層層析鑒別分析

在以上160 餾份中，從第35 份開始，間隔用TLC 方法檢測(吸附劑∶硅膠GF254-CMC-Na，顯色劑:l% AlCl3/EtOH，展開劑見表1)。

表1 各薄層層析方法檢測所用展開劑Table 1 Elution solvents for different TCL methods

1.2.5 紫外光譜掃描

將1 mg 乙酸乙酷浸膏用甲醇(FCP)溶解過濾制得樣品液，又以甲醇(FCP)作參比液，用UV-2100雙光束紫外可見分光光度計，在波長200～500 nm范圍，對蘆丁、槲皮素、二氫楊梅素標準液和樣品液進行紫外光譜掃描。

1.2.6 雞足葡萄總黃酮成份的HPLC 分析

色譜柱:Agilent Zorbax SB-C18，流動相:甲醇∶水=60∶40，體積流量:0.09 mL/min，檢測波長:254、290、360 nm。

分別精密稱取經五氧化二磷干燥24 h 的槲皮素、蘆丁、二氫楊梅素對照品，各加甲醇制成200、100、50 μg/mL 的儲備液。以流動相為稀釋液配之每1 mL 分別含4 μg 槲皮素、4 μg 蘆丁、1 μg 二氫楊梅素的混合液，作為對照品溶液。

1.2.7 洗脫液不同餾份的HPLC 分析

色譜柱:Agilent Zorbax SB-C18，流動相:甲醇∶水=60∶40，流速:0.08 mL/min，檢測波長:254 nm。

在以上160 餾份中，從第35 份開始，間隔取5 mL，轉入50 mL 容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.145 μm)濾過，取濾液作為供試品溶液。

1.2.8 雞足葡萄的蘆丁含量的測定

色譜柱:Agilent Zorbax SB-C18，流動相:甲醇∶水=60∶40，體積流量:1.00 mL/min，檢測波長:257 nm。

1.2.8.1 蘆丁標準曲線的制定

稱取120 ℃減壓干燥至恒重的蘆丁對照品14.95 mg，置50 mL 容量瓶中，加甲醇溶解至刻度。精密吸取上述蘆丁對照品溶液3、6、10、15、20、25 μL(進樣量分別為0.897、1.794、2.990、4.485、5.980、7.475 μg)進樣檢測，測得峰面積以對照品量(μg)為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標，計算回歸方程。

1.2.8.2 精密度試驗

取濃度為45.07 mg/L 的對照品溶液，重復進樣5 次，計算峰值面積，計算RSD。

1.2.8.3 穩定性試驗在本試驗條件下，供試品溶液室溫放置8 h，每隔2 h 進料20 μL，記錄峰面積，計算RSD。

1.2.8.4 回收率試驗

精確稱取己知含量的樣品5 份，加入1.5 mg 蘆丁對照品，測定蘆丁的含量，計算回收率及RSD 值。

1.2.8.5 樣品中蘆丁含量的測定

取產自湖南邵陽的雞足葡萄葉，莖混合干份5份，每份1 g，75%乙醇浸泡過夜，料液比1∶10，80 ℃溶劑回流兩次，每次4 h，合并，減壓過濾回流提取液得粗提液，移入100 mL 的容量瓶中，甲醇定容，得供試品溶液。

2 結果與分析

2.1 黃酮類化合物定性檢驗結果

粗提液1、2 的定性檢驗結果見表2。由表2 可以看出，該植物粗提液中含C5-OH 黃酮類、黃酮醇類、二氫黃酮類、黃酮苷類等，但濃鹽酸反應溶液并沒有明顯的粉紅色生成，表明其不含花青素或含量很少。

表2 黃酮類物質的定性檢驗結果Table 2 Qualitative analysis results of flavonoid component

2.2 薄層鑒別

2.2.1 薄層層析鑒別系統的選擇

經過初步試驗，選定3 組展開系統，分別是石油醚∶乙酸乙脂∶甲酸=3∶12∶1;石油醚∶乙酸乙脂∶甲酸=3∶18∶1;乙酸乙脂∶丙酮∶甲酸∶水=8∶3∶1∶1。3個系統均有3 個熒光斑點，但斑點1 較大，拖尾較嚴重，可能是多種物質混合所致，對3 個系統的樣品的每個熒光斑點。展開系統石油醚∶乙酸乙酯∶甲酸=3∶12∶1 的分離度較其它兩個系統大，分離效果好，且穩定，因此更加適合該物種黃酮類物質的薄層鑒別分離。

2.2.2 不同產地總黃酮的薄層層析鑒別比較

將粗提液1(湖南衡山)，粗提液2(湖南邵陽)分別在展開系統石油醚∶乙酸乙酯∶甲酸=3∶12∶1中進行分離，上行展開，取出硅膠薄層板，用吹風機吹干后于紫外分析儀下檢視，結果顯示，粗提液2 的斑點數目比粗提液1 的斑點數目要高，且分離效果比粗提液1 要好，說明粗提液1 中的黃酮化學物質的種類數較粗提液2 中豐富，同時表明采自湖南邵陽的雞足葡萄的黃酮類化學成分的種類較豐富，有進一步開發的潛力。

2.2.3 洗脫液不同餾份的薄層層析鑒別分析

在以上160 餾份中，從第35 份開始，間隔用TLC 方法檢測。餾分69、70 最上部的斑點消失，最后根據各個餾份的薄層檢測結果，合并相同餾份，留下濃縮液2、3、4。

2.3 紫外光譜掃描

將乙酸乙脂萃取液用甲醇(FCP)溶解過濾制得樣品液，又以甲醇(FCP)作參比液，用UV-2100 雙光束紫外可見分光光度計，在波長200～400 nm 范圍，對蘆丁、槲皮素、二氫楊梅素標準液和乙酸乙酯提取液進行紫外光譜掃描。見圖1。

圖1 雞足葡萄乙酸乙酯提取液的紫外吸收光譜Fig.1 UV spectrum of ethyl acetate extract of V.lanceolatifoliosa

由圖1 可以看出，雞足葡萄乙酸乙酯提取液在226、290、350 nm 處有特征吸收峰，峰值分別為3.9829、2.5604、1.0994，在350 nm 處的吸收峰較弱，而226 nm 處可能是溶劑所形成的峰，符合雙氫黃酮類的紫外光譜特征，由此推斷該提取液的黃酮類成分的主要物質為雙氫黃酮類。

2.4 雞足葡萄總黃酮成分的HPLC 分析

經初步分析，將甲醇溶解后的乙酸乙酯萃取液在254 nm 波長下進行檢測，結果見圖2、3。

圖2 蘆丁標準液的HPLC 色譜圖(254 nm)Fig.2 HPLC chromatogram of rutin standard

圖3 乙酸乙酷提取液的HPLC 色譜圖(254 nm)Fig.3 HPLC chromatogram of ethyl acetate extract of V.lanceolatifoliosa

結合圖2 可以看出，蘆丁標準液和乙酸乙酯提取液的出峰時間一致由此可以推斷該峰為蘆丁，該雞足葡萄中有蘆丁存在，而其它峰的出峰時間與槲皮素，二氫楊梅素標準品的出峰時間并不一致，可判定該物種中并不存在上述兩種物質。

2.5 洗脫液不同餾份的HPLC 分析

色譜柱:Agilent Zorbax SB-C18，流動相:甲醇∶水=60∶40，體積流量:0.09 mL/min，檢測波長:254 nm。濃縮液2、3、4 的HPLC 色譜結果見圖4。

圖4 濃縮液2(A)、3(B)及4(C)的HPLC 色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of extract 2(A)，3(B)and 4(C)

從上圖可知，蘆丁主要存在于濃縮液3、4 中，在濃縮液3、4 中的主峰之一(出峰時間5.568 min，5.495 min)的物質是該物種黃酮類的主要物質，綜合乙酸乙酯萃取液的紫外光譜掃描研究，進而確定該物質為二氫黃酮類，但該物質和其它主峰物質的詳細結構仍然需要通過制備液相色譜、核磁共振等手段進行進一步的研究。

2.6 雞足葡萄的蘆丁含量的測定

2.6.1 蘆丁對照品的全波段掃描

根據掃描結果和掃描數據發現蘆丁對照品在218、257、358 nm 處有吸收峰，其中257 nm、358 nm處為黃酮類的特征峰，218 nm 處可能是溶劑所形成的峰，且最大吸收峰出現在257 nm 處，故選擇257 nm 做為測定波長。

圖5 蘆丁(0.06 mg/mL)對照品UV 掃描圖Fig.5 UV spectrum of rutin standard(0.06 mg/mL)

2.6.2 蘆丁標準曲線的制作

按前述方法，測定蘆丁的吸收峰面積分別為32.291、50.342、71.991、100.170、127.121、152.512，計算得到回歸方程，表明蘆丁含量在0.897～7.475 μg/mL 范圍內與吸光度線性關系良好。

2.6.3 精密度試驗

5 次的峰值面積分別為33.717、33.661、33.351、33.153、33.258，計算RSD=0.73%(n=5)。

2.6.4 穩定性試驗

在本次試驗條件下，測得5 次的供試品溶液的峰面積為33.221、33.214、32.730、32.215、32.126，計算RSD=1.53%。

2.6.5 回收率試驗

回收率結果見表3。

表3 回收率試驗結果Table 3 Test result of recovery rate

2.6.6 樣品中蘆丁含量的測定

計算得該樣品中的蘆丁含量為4.27 mg/g，RSD=l.2%，表明該方法重復性良好。

3 討論

黃酮類化合物是一類在植物界中分布廣泛、具有多種生物活性的多酚類化合物。如白果雙黃酮和葛根總黃酮等，對心血管疾病有治療作用;木犀草素、輕基芫花素和杜鵑素等能治療氣管炎;竹葉黃酮具有優良的抗自由基、抗氧化、抗衰老、降血脂、免疫調節、抗菌等生物學功效，在人類的營養、健康和疾病防治上有著廣闊的應用前景［2-4］。

雞足葡萄含有的黃酮類化合物是多樣的，并多以苷的形式存在，通過定性檢驗、薄層色譜分析、紫外光譜掃描、液相色譜和物理性質檢測。結果證實，雞足葡萄所含黃酮類化合物的成分主要為黃酮、黃酮醇類(蘆丁)、二氫黃酮類等，而二氫黃酮類的含量較其它成分要高，初步確定黃酮類甜味成分為二氫黃酮類，并測得蘆丁含量為4.27 mg/g。

1 Flora of China Editorial Committee(中國植物志編委會).Flora of China(中國植物志).Beijing:Science Publishing House，1959.

2 Middleton JR.Biologieal properities of plant flavonoid:a noverview.Int J Phannaeognos，1996，(34):344-348.

3 HAVESTEEN B.Flavonoids，a class of natural produets of high phannaeologieal poteney.Biochemieal Phanneology，1983，32:1141-1148.

4 Zhang Y(張英)，Wu XQ(吳曉琴)，Yu ZY(俞卓裕).Comparison study on total flavonoid content and anti-free redical activity of the leaves of Bamboo，phyllostachys nigra，and Ginkgo bilabo.Chin J Chin Mater Med(中國中藥雜志)，2002，27:254-257.