紅樹林內生真菌Pestalotiopsis versicolor 的化學成分研究

白志強，林秀萍，楊 斌，周雪峰，王俊峰，劉永宏*

1中國科學院南海海洋研究所 中國科學院海洋生物資源可持續利用重點實驗室，廣州 510301;2 中國科學院大學，北京 100049

近年來，從海洋真菌代謝產物得到了許多結構新穎、活性顯著的藥物［1］。內生真菌(endophytic fungi)指生活于生物組織內部、不會對生物組織致病的一類真菌。內生真菌全部或部分生活周期都在寄主體內，與之形成互惠共生的關系:一方面，寄主為其提供必需的光合產物、礦物質等，以及相對穩定的生活環境;另一方面，內生真菌產生的活性代謝產物，或能刺激該生物生長發育，或能提高宿主對外界環境的抵抗能力［2］。目前，內生真菌已經成為發現結構新穎、活性明顯的次級代謝產物的重要來源［3，4］。其中從內生擬盤多毛孢菌的代謝產物中發現了許多結構新穎的化合物，引起了人們的廣泛重視［5］，如抗HIV 的pestalatazines［6］，具有細胞毒活性的pestaloficiols［7］，具有抗真菌活性的pestafolide A［8］。我們在對Pestalotiopsis versicolor 菌株液體發酵培養后，從該菌株的代謝產物中分離得到了8 個化合物，它們均為首次從該菌株中分離得到。

1 材料和儀器

該擬盤多毛孢菌菌株采集自我國南海海域的紅樹林植物桐花樹的樹枝，為內生真菌，經鑒定為Pestalotiopsis versicolor。該菌種目前保藏于中國科學院南海海洋研究所海洋生物資源可持續利用重點實驗室。

薄層硅膠板(煙臺江友硅膠開發有限公司);硅膠H(青島海洋化學儀器廠);Sephadex LH-20 柱色譜凝膠(Pharmacia 公司)。顯色劑:5%硫酸乙醇溶液;碘。所用試劑均為化學純，購自廣州化學試劑廠。

BS110S 型電子天平(德國塞多利斯股份公司);EYELAN-1001 型旋轉蒸發儀(上海愛郎儀器有限公司);SHZ-CB 型循環水真空泵(鞏義市予華儀器有限公司);KQ-250DB 型超聲儀(鞏義市予華儀器有限公司);AVANCE 500 核磁共振儀(美國BRUKER 公司);MAT 95XP 快原子轟擊質譜儀(美國熱電公司);HYG-C 三層多功能搖床(北京博宇寶威實驗設備有限公司);立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋(合肥華泰醫療器械有限公司)。

2 實驗方法

2.1 發酵培養

從采自我國南海海域的紅樹林桐花樹的樹枝分離得到一株內生擬盤多毛孢真菌，對其固體發酵產物全面系統地研究之后，發現它能產生一些具有細胞毒活性和抗病毒活性的新化合物和新天然產物［9］。因此，我們對該真菌菌株進行大規模液體發酵研究。發酵方法如圖1，培養過程中所用培養基均為馬鈴薯PDA 培養基［10］。種子培養液在搖床中培養時轉速設定為180 rpm，整個培養過程中的溫度均為25 ℃。

圖1 發酵培養過程Fig.1 The fermentation process

2.2 提取分離

發酵結束后，對發酵產物用丙酮按照1∶1 比例進行滅活萃取、提取三次后將菌絲體與液體培養基分離，分別進行萃取，經HPLC 分析后合并萃取物，得到油狀浸膏約60 g。對該粗浸膏用90%甲醇溶解后用正己烷萃取，得甲醇水部位約45 g 樣品，經中壓硅膠色譜柱分離后，得到11 個餾分。所得各餾分經過凝膠Sephadex LH-20，常壓硅膠色譜柱后，經薄層制備(HPTLC)以及重結晶等方法分離得到8個化合物。化合物1，約50 .0mg;化合物2，約7.3 mg;化合物3，約4.2 mg;化合物4，約5.8 mg;化合物5，約10.0 mg;化合物6，約8.0 mg;化合物7，約8.0mg;化合物8，約10.0 mg。

3 結果分析

化合物1 白色粉末(氯仿)，1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:5.58(1H，d，J=3.0 Hz，H-6)，5.39(1H，m，H-7)，5.22(1H，dd，J=15.0，7.0 Hz，H-22)，5.16(1H，d，J=15.0，7.0 Hz，H-23)，3.68(1H，m，H-3)，2.49(1H，d，J=7.5 Hz，H-14)，2.31(1H，t，J=13.5 Hz，H-25)，1.97(1H，t，J=1.5 Hz，H-9)，1.04(3H，d，J=6.5 Hz，H-27)，1.02(3H，J=6.5 Hz，H-26)，0.99(3H，s，H-21)，0.92(3H，d，J=7.0 Hz，H-19)，0.83(3H，s，H-28)，0.64(3H，s，H-18);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:141.4(C-8)，139.8(C-5)，135.6(C-22)，132.1(C-23)，119.6(C-6)，116.4(C-7)，70.5(C-3)，55.9(C-17)，54.6(C-14)，46.4(C-9)，43.6(C-13)，42.9(C-24)，40.9(C-4)，40.4(C-20)，39.2(C-12)，38.4(C-10)，33.1(C-25)，32.1(C-2)，28.3(C-16)，23.0(C-15)，21.2(C-11)，19.9(C-21)，19.7(C-27)，19.7(C-28)，17.6(C-26)，16.3(C-19)，12.1(C-18);LR-EI-MS m/z［M-H］-395。以上數據與文獻報道［11］一致，確定該化合物為麥角甾醇(Ergosterol)。

化合物2 白色無定型粉末(氯仿)，1H NMR(CDCl3，500 MHz)，δ:5.60(1H，s，H-7)，5.31(2H，m，H-22，H-23)，3.98(1H，m，H-3)，0.69(3H，s，H-19)，1.01(3H，s，H-19)，1.07(3H，d，J=6.5 Hz，H-21)，0.88(6H，d，J=7.0 Hz，H-26，H-27)，0.97(3H，d，J=6.5 Hz，H-28);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:197.8(C-6)，164.5(C-8)，135.1(C-22)，132.5(C-23)，119.8(C-7)，116.4(C-7)，79.7(C-5)，74.7(C-9)，67.3(C-3)，56.0(C-17)，51.8(C-14)，45.3(C-13)，41.8(C-10)，40.3(C-20)，37.1(C-4)，34.9(C-12)，33.1(C-25)，30.1(C-2)，28.8(C-11)，25.5(C-1)，22.8(C-16)，22.3(C-15)，21.1(C-21)，20.4(C-19)，19.9(C-27)，19.6(C-26)，17.6(C-28)，12.2(C-18);LR-EI-MS m/z ［M +Na］+467。以上數據與文獻報道［12］一致，確定該化合物為3β，5α，9α-三羥基-7-22 麥角甾二烯-6-酮。

化合物3 白色粉末(氯仿)，1H NMR(CDCL3，500 MHz)，δ:5.24(2H，m，H-22，H-23)，3.97(2H，m，H-3，H-6)，3.31(1H，d，J=2.5 Hz，H-7)，0.61(3H，s，H-18)，0.84(3H，d，J=14.5 Hz，H-28)，0.86(3H，d，J=10.0 Hz，H-27)，0.93(3H，d，J=7.5 Hz，H-25)，1.02(3H，d，J=6.5 Hz，H=21);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:135.6(C-22)，134.5(C-9)，132.1(C-33)，127.0(C-8)，68.6(C-3)，67.2(C-6)，65.7(C-5)，62.6(C-7)，53.8(C-17)，49.7(C-14)，42.9(C-24)，42.2(C-13)，40.4(C-20)，393(C-4)，38.1(C-10)，35.8(C-12)，33.2(C-26)，30.9(C-2)，30.3(C-1)，29.0(C-15)，23.9(C-11)，23.5(C-16)，22.8(C-19)，20.9(C-21)，19.9(C-27)，19.7(C-28)，17.7(C-25)，11.4(C-18);LR-EI-MS m/z［M+H］+447。以上數據與文獻報道［13］基本一致，確定該化合物為ergosta-8(9)，22-diene-3，5，6，7-tetraol(3β，5α，7α，22E)。

化合物4 白色粉末(甲醇)，1H NMR(MeOD，500 MHz)，δ:4.25(1H，dd，J=5.0 Hz，H-5)，4.19(2H，t，J=6.5 Hz，H-7)，2.52(1H，m，H-4a)，2.27(1H，m，H-4b)，2.44(2H，m，H-3)，1.67(2H，m，H-8)，1.41(2H，m，H-9)，0.96(3H，t，J=7.5 Hz，H-10);13C NMR(MeOD，125 MHz)δ:177.4(C-6)，171.9(C-2)，65.6(C-7)，55.4(C-5)，30.6(C-8)，29.1(C-3)，24.9(C-4)，19.1(C-9)，13.6(C-10);LR-EI-MS m/z［M +H］+186。以上數據與文獻報道［14］一致，確定該化合物為butyl 2-pyrrolidone-5-carboxylate。

化合物5 白色粉末(甲醇)，1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:1H NMR(MeOD，500 MHz)，δ:7.25(1H，s，H-6)，1.86(3H，s，H-5);13C NMR(CDCl3，125 MHz)，δ:163.7(C-4)，151.0(C-2)，140.2(C-6)，107.1(C-5)，18.1(C-5)。以上數據與文獻報道［15］一致，由此鑒定該化合物為胸腺嘧啶。

化合物6 白色粉末(甲醇)，1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:7.41(1H，d，J=7.5 Hz，H-6)，5.72(1H，d，J=7.5，H-5);13C NMR(CDCl3，125 MHz)，δ:166.4(C-4)，153.5(C-2)，141.3(C-6)，101.6(C-5);LR-EI-MS m/z［M+H］+113。以上數據與文獻報道［15］一致，故確定為尿嘧啶。

化合物7 白色粉末(甲醇)，1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:7.71(2H，m，H-2，H-5)，7.53(2H，m，H-3，H-4)，4.31(4H，t，J=6.5 Hz，H-1')，1.74(4H，m，H-2')，1.47(4H，m，H-3')，0.97(3H，t，J=7.5 Hz，H-Me-4');13C NMR(MeOD，125 MHz)δ:167.7(C-7)，166.4(C-4)，132.3(C-1，C-6)，130.9(C-3，C-4)，128.8(C-2，C-5)，65.6(C-1')，30.6(C-2')，19.2(C-3')，13.7(C-4');LR-EI-MS m/z［M +H］+279。以上數據與文獻［16］報道一致，確定該化合物為鄰苯二甲酸正丁酯。

化合物8 白色粉末(氯仿)，1H NMR(MeOD，500 MHz)，δ:9.79(1H，s，H-7)，7.81(2H，d，J=8.5 Hz，H-2，H-6)，6.94(2H，d，J=8.5 Hz，H-3，H-7);13C NMR(MeOD，125 MHz)δ:191.0(C-1)，166.4(C-4)，133.1(C-2，H-6)，129.6(C-1)，117.4(C-3);LR-EI-MS m/z［M+H］+122。以上數據與文獻［17］報道一致，確定該化合物為對羥基苯甲醛。

1 Rateb ME，Ebel R.Secondary metabolites of fungi from marine habitats.Nat Prod Rep，2011，28:290-344.

2 Bi JN，et al.A new taxol-producing fungus(Pestalotiopsis malicola)and evidence for taxol as a transient product in the culture.Afr J Biotechnol，2011，10:6647-6654.

3 Dreyfuss MM，Chapela IH.Potential of fungi in the discovery of novel，low-molecular weight pharmaceuticals.Biotechnology，1994，26:49-80.

4 Brase S，et al.Chemistry and biology of mycotoxins and related fungal metabolites.Chem Rev，2009，109:3903-3990.

5 Xu J，Ebada SS，Proksch P.Pestalotiopsis a highly creative genus:chemistry and bioactivity of secondary metabolites.Fungal Divers，2010，44:15-31.

6 Ding G，et al.Pestalazines and pestalamides，bioactive metabolites from the plant pathogenic fungus Pestalotiopsis theae.J Nat Prod，2008，71:1861-1865.

7 Liu L，et al.Isoprenylated chromone derivatives from the plant endophytic fungus Pestalotiopsis fici.J Nat Prod，2009，72:1482-1486.

8 Ding G，Liu SC，Guo LD，et al.Antifungal metabolites from the plant endophytic fungus Pestalotiopsis foedan.J Nat Prod，2008，71:615-618.

9 Sun JF，Huang H，Chai XY，et al.Dichotellides A-E，five iodine-containing briarane type diterpenoids from Dichotella gemmacea.Tetrahedron.2011，67:1245-1250.

10 Proksch P，Kjer J，Debbab A，et al.Methods for isolation of marine-derived endophytic fungi and their bioactive secondary products.Nat Protoc，2010，5:479-490.

11 Zhou WX，Nes WD.Stereochemistry of hydrogen introduction at C-25 in ergosterol synthesized by the mevalonate-independent pathway.Tetrahedron Lett，2000，41:2791-2795.

12 Kawagishi H，et al.Cyto-toxic steroids from the mushroom agaricus-blazei.Phytochemistry，1988，27:2777-2779.

13 Li HJ，Lin YC，Vrijmoed LLP，et al.A new cytotoxic sterol produced by an endoPhytic fungus from castaniopsis fissa at the south china sea coast.Chin Chem letts，2004，15:419-422.

14 Park MR，Kim YC，Lee S，et al.Identification of an ISR-related metabolite produced by rhizobacterium klebsiella oxytoca C1036 active against soft-rot disease pathogen in tobacco.Pest Manag Sci，2009，65:1114-1117.

15 Liao XJ(廖小建)，et al.Studies on chemical constituents from callysp ongia fibrosa.Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory(光譜實驗室)，2005，22:281-283.

16 Chen Y(陳赟)，Tian JK(田景奎)，Cheng YY(程翼宇).Studies on chemical constituents of Ranunculus ternatus.ChinPharm J(中國藥學雜志)，2005，40:1373-1375.

17 Que DM(闕東枚)，Dai HF(戴好富)，Huang GX(黃貴修)，et al.Chemical constituents from the endophytic fungus Rhizoctonia sp.J5 of Antias toxicaria.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2009，21:424-427.