廣東桑根心材的化學(xué)成分研究

何細(xì)新 ，巢曉娟，楊 璐，張翠仙，皮榮標(biāo)，曾海祥，李國西，徐玉娟，林燕燕

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院;2 中山大學(xué)藥學(xué)院，廣州 510006

桑屬植物具有廣泛的藥用價值。如桑(Morus abla L.)的枝、葉、果、根皮均可入藥，其中桑葉具有疏散風(fēng)熱，清肺潤燥，清肝明目功效;桑椹能滋陰補(bǔ)血，生津潤燥;桑枝祛風(fēng)濕，利關(guān)節(jié);桑白皮則瀉肺平喘，利水消腫［1］。化學(xué)成分研究顯示，桑屬植物富含黃酮類化合物，苯駢呋喃衍生物，生物堿，香豆素，甾體，揮發(fā)油等多種成分［2］，具有降血壓、抑菌、消炎鎮(zhèn)痛，抗癌，抗病毒等多種藥理作用［3］。

廣東桑Morus atpropurpurea 主要在廣東、廣西地區(qū)廣泛栽培。近年來，廣東桑的不同部位，如種子［4］，桑枝［5］，根皮［6］的化學(xué)成分已有報道。本文對廣東桑根心材部分的化學(xué)成分進(jìn)行研究，從中分離得到8 個已知化合物，并對其多酚類化合物進(jìn)行了抗氧化和神經(jīng)保護(hù)作用研究，為廣東桑的資源利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Brucker 400 MHz 型核磁共振儀;Thremo LCQ DECA XP 質(zhì)譜分析儀;層析硅膠(200～300 目)，青島海洋化工廠產(chǎn);Sephdax LH-20，Merck 公司產(chǎn)品;D101 型陽離子交換樹脂，購置于南開大學(xué)化工廠;其他所用溶劑均為分析純;3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，美國Sigma 公司;酶標(biāo)儀，美國Bio-Tek 公司;分光光度計，美國Varian 公司。

1.2 生物材料

廣東桑根于2010 年8 月采自廣東湛江，種屬由廣州中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室鑒定。樣品編號為MA2010-ZJ。儲藏于廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥化學(xué)實驗室，研究所用材料為其心材部分。

1.3 提取與分離

將廣東桑根的心材(干重1.3 kg)粉碎后用95%乙醇回流提取3 次，減壓濃縮提取液，得棕褐色濃縮物，將濃縮物用200 毫升水懸浮，然后分別以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3 次，乙酸乙酯萃取液濃縮后得浸膏14 g。將此浸膏經(jīng)硅膠(200～300目)層析分離，以石油醚/乙酸乙酯洗脫。石油醚/乙酸乙酯(體積比6∶4)洗脫部分經(jīng)Sephadex LH-20，甲醇洗脫得化合物1(15 mg)，2(10 mg)，3(15 mg)，4(100 mg);石油醚/乙酸乙酯(體積比4∶6)洗脫部分，經(jīng)Sephadex LH-20 進(jìn)一步分離，甲醇洗脫得化合物5(5 mg)，6(5 mg);乙酸乙酯洗脫部分，經(jīng)甲醇重結(jié)晶得化合物7(10 mg)。正丁醇部分約8 g，經(jīng)D101 型陽離子交換樹脂層析，先以水洗2 個保留體積，然后0.2M 氨水洗脫。氨水洗脫部分，依次經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇洗脫)，硅膠柱層析(200～300目)，從甲醇∶氯仿(體積比4∶6)流份中得化合物8(60 mg)。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)解析

化合物1 白色固體，ESI-MS m/z:311［M +H］+;1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ 7.32(1H，d，J=8.4 Hz，H-4)，6.88(1H，d，J=1.9 Hz，H-7)，6.83(1H，d，J=0.8 Hz，H-3)，6.78(2H，s，H-2'，6')，6.72(1H，dd，J=8.4，2.1 Hz，H-5)，5.37-5.05(1H，t，J=7.2Hz，H-8')，3.33(2H，d，J=7.2 Hz，H-7')，1.78(3H，s，-CH3)，1.67(3H，s，-CH3);13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ157.5(C-3'，5')，157.1(C-6)，156.6(C-8)，156.5(C-2)，131.3(C-9')，130.2(Cl')，124.3(C-8')，123.2(C-9)，121.8(C-4)，116.9(C-4')，113.1(C-5)，103.8(C-2'，6')，101.3(C-3)，98.4(C-7)，26.0(-CH3)，23.3(C-7')，17.9(-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［7］報道的Moracin C 的數(shù)據(jù)一致，將化合物1 鑒定為Moracin C。

化合物2 淡灰色固體，ESI-MS m/z:243［M+H］+;1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ 7.34(1H，d，J=8.4 Hz，H-4)，6.91(1H，d，J=2.3Hz，H-6)，6.90(1H，s，H-3)，6.78(2H，d，J=2.2 Hz，H-2'，6')，6.74(1H，dd，J=8.4，2.0 Hz，H-5)，6.27(1H，t，J=2.2 Hz，H -4');13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ160.5(C-3'，5')，157.7(C-7a)，157.3(C-6)，156.6(C-2)，134.3(C-1')，123.5(C-3a)，122.5(C-4)，113.7(C-5)，104.5(C-2'，6')，104.1(C-4')，102.7(C-3)，98.9(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］報道的Moracin M 的數(shù)據(jù)一致，鑒定化合物2 為Moracin M。

化合物3 無色針狀結(jié)晶，ESI-MS:m/z 305［M+H］+;1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ 7.24(1H，d，J=9.0 Hz，H-6')，6.42-6.34(2H，m，H-3'，5')，5.94(1H，d，J=2.1 Hz，H-8)，5.90(1H，d，J=2.1 Hz，H-6)，5.41(1H，d，J=11.4 Hz，H-2)，4.79(1H，d，J=11.4 Hz，H-3);13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ 199.02(C-4)，168.68(C-5)，165.42(C-9)，165.10(C-7)，160.27(C-4')，158.70(C-2')，130.97 (C-6')，115.72 (C-1')，108.08 (C-5')，103.90(C-3')，102.06(C-10)，97.30(C-8)，96.37(C-6)，80.17(C-2)，72.68(C-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］報道的二氫桑色素的數(shù)據(jù)一致，將化合物3 定為二氫桑色素。

化合物4 淡黃色結(jié)晶，ESI-MS:m/z 245［M+H］+;1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ 7.33(1H，d，J=9.2 Hz，H-6)，7.27(1H，d，J=16.5 Hz，H-α)，6.82(1H，d，J=16.4 Hz，H-β)，6.46(2H，d，J=2.1 Hz，H-2'，6')，6.34-6.31(2H，m，H-3，5)，6.15(1H，t，J=2.2 Hz，H-4);13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ158.2(C-3'，5')，157.8(C-2)，155.9(C-4)，140.77(C-1')，127.0(C-α)，125.0(C-β)，123.0(C-6)，116.0(C-1)，106.9(C-5)，104.2(C-2，6)，102.0(C-3)，100.8(C-4')。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］報道的氧化白藜蘆醇的數(shù)據(jù)一致，鑒定化合物4 為氧化白藜蘆醇。

化合物5 淡黃色針狀結(jié)晶，ESI-MS m/z:163［M+H］+;1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ 7.86(1H，d，J=9.4 Hz)，7.47(1H，d，J=8.5 Hz)，6.81(1H，dd，J=8.5，2.3 Hz)，6.73(1H，d，J=2.2 Hz)，6.20(1H，d，J=9.4 Hz);13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ:163.7(C-2)，163.1(C-9)，157.3(C-7)，146.0(C-4)，130.7(C-5)，114.5(C-3)，113.2(C-10)，112.4(C-6)，103.4(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］報道的傘形花內(nèi)酯的數(shù)據(jù)一致，鑒定化合物5 為傘形花內(nèi)酯。

化合物6 灰白色固體，空氣中長期放置變黃色粉末結(jié)晶。ESI-MS m/z:139［M +H］+;1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ 9.72(1H，s，CHO)，7.51(1H，d，J=8.6 Hz，1H，H-6)，6.46(1H，dd，J=8.6，2.2 Hz，H-5)，6.29(1H，d，J=2.2 Hz，H-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［12］基本一致，鑒定該化合物為2，4-二羥基苯甲醛。

化合物7 白色粉末，TLC 分析與胡蘿卜苷標(biāo)準(zhǔn)品Rf值一致，與胡蘿卜苷混合熔點不下降，鑒定該化合物為胡蘿卜苷［13］。

化合物8 無色油狀物，ESI-MS m/z:116［M+H］+;1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ 4.03(1H，dd，J=8.5，6.3 Hz，H-3)，3.41(1H，dt，J=11.5，6.9 Hz，H-4)，3.28(1H，dt，J=11.4，7.3 Hz，H-4)2.32(1H，td，J=15.7，7.4 Hz，H-6)，2.13(1H，td，J=13.3，6.4 Hz，H-6)，2.06-1.94(2H，m，H-5).13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ174.14(C-2)，62.47(C-3)，46.85(C-6)，30.26(C-4)，24.99(C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)一致［14］，鑒定化合物為3-羥基-2-哌啶酮(3-Hydroxy-2-piperidinone)。該化合物首次從桑屬植物中得到。

2.2 DPPH 自由基清除率測試

利用DPPH 溶液的特征紫紅色團(tuán)的吸收峰，以分光光度法測定加抗氧化劑后，在517 nm 處吸光度減少值，表示其對有機(jī)自由基消除能力［15］。在反應(yīng)管中加入1 mL 0.2 mM DPPH 的甲醇溶液，再加入1 mL 的化合物1～4 和白藜蘆醇終濃度為(2.0，4.0，8.0，16.0 和32.0 μM)，混合均勻，室溫避光反應(yīng)60 min 后在517 nm 處讀取吸光度。設(shè)1 mL DPPH+1 mL 化合物溶液為實驗組，同時以1 mL DPPH+1mL甲醇混合后的吸光度為對照組。計算清除率(%)=［(對照組A517-實驗組A517)/對照組A517］×100%。計算使DPPH 溶液吸光度降低50%的化合物濃度(IC50)。將IC50定義為清除50%DPPH 有機(jī)自由基的化合物濃度。結(jié)果見表1。由結(jié)果顯示，化合物1～4 都具有自由基清除能力。其中化合物1 和4 對DPPH 自由基清除能力的IC50低于白藜蘆醇的IC50，提示它們的清除自由基能力強(qiáng)于白藜蘆醇。

表1 化合物抗氧化活性(IC50，μM)Table 1 The antioxidant activity of compounds(IC50，μM)

2.3 HT22 神經(jīng)元細(xì)胞保護(hù)活性測試

在96 孔板中種入HT22 細(xì)胞(每孔1*104個)，然后加入空白和設(shè)定濃度的化合物預(yù)處理30 min，再加入空白和L-谷氨酸鈉(5 mM)孵化24 h。細(xì)胞存活率采用MTT 法測試，活性結(jié)果見圖1。由結(jié)果顯示，化合物1，2，3，4 在5 μM 和20 μM 兩個濃度下均有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。未加L-谷氨酸鈉情況下，20 μM 化合物1，2，3，4 降低HT22 細(xì)胞活力。L-谷氨酸鈉能夠造成HT22 細(xì)胞死亡，化合物1～4的加入均能減少L-谷氨酸鈉誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，增加存活率。其中化合物2 在高濃度(20 μM)下活性顯著。

圖1 化合物1，2，3，4 對L-谷氨酸鈉誘導(dǎo)HT22 細(xì)胞毒性的影響Fig.1 Effects of compound 1、2、3、4 on L-Glutamate induced cytotoxicity.Cells were grown on 96-well plates(1* 104 cells per well)and pretreated with or without compounds as indicated concentrations for 30 min，and then incubated with or without L-Glutamate(5 mM)for 24 h.Cell viability was measured using the MTT assay.

3 結(jié)論與討論

本研究從廣東桑根的心材中分離了8 個已知化合物，經(jīng)分析將其分別鑒定為桑辛素C(1)，桑辛素M (2)，二氫桑色素(3)，氧化白藜蘆醇(4)，2，4-二羥基苯甲醛(5)，傘形花內(nèi)酯(6)，胡蘿卜苷(7)和3-羥基-2-哌啶酮(8)。其中化合物1，3～6 和8 為首次從廣東桑Morus atpropurpurea 中分離得到。化合物8 亦首次從桑屬植物中分離到。活性研究顯示多酚類化合物1～4 均具能清除DPPH 自由基，其中化合物1 和4 的清除能力高于白藜蘆醇;均能抑制L-谷氨酸鈉誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元細(xì)胞HT22 毒性，具有神經(jīng)保護(hù)，其中化合物2 在20 μM 濃度下活性顯著。

桑屬植物具有多種藥理活性，包括對心血管系統(tǒng)有降血壓作用、提取物在體外有抑菌作用、消炎鎮(zhèn)痛作用，還有抗癌抗病毒等藥理活性作用。此外，有研究報道［16］桑色素可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞在S 期中阻滯，從而抑制細(xì)胞增殖。本研究采用的永生系小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞HT22 是一種可增殖的細(xì)胞，化合物1～4 處理24 h 后，HT22 細(xì)胞的活力有所降低，可能是由于化合物對細(xì)胞產(chǎn)生抑制增殖作用，而不是毒性作用。其抑制細(xì)胞增殖的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。另外，有報道桑色素具有神經(jīng)保護(hù)作用［17］，手術(shù)前3 d 給予桑色素(4 mg/kg)可以減少腦缺血再灌注大鼠模型的梗死面積，減少炎性細(xì)胞浸潤，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。本研究發(fā)現(xiàn)從廣東桑根的心材中分離得到的化合物1、2、3 和4 均可清除自由基，減少由氧化應(yīng)激引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷，這對于廣東桑提取物作為抗氧化劑和神經(jīng)保護(hù)劑，應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了一定的實驗依據(jù)。但僅是體外實驗研究，尚有待更進(jìn)一步的開展動物水平實驗。

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