貢菊黃酮抗小鼠急性肝損傷作用的研究

張寬朝，文 漢，胡雅萍，王 雪

安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥 230036

黃山貢菊，又稱徽菊，是從菊花群體中選育出的優(yōu)良品種，因在古代被作為貢品獻給皇帝，故名“貢菊”［1］。其品質(zhì)優(yōu)良，色、香、味、型集于一體，既有觀賞價值，又有藥用功能，是安徽黃山市特有的地方名貴中藥材，也是高級保健飲料佳品，在國內(nèi)外有很大影響［1-3］。黃山貢菊氣芳香，味甘微苦，具有疏風散熱、養(yǎng)肝明目、清涼解毒之功能，可治傷風感冒、疔瘡腫毒、血壓偏高及動脈硬化等癥，被“中國藥典”譽為“菊中之冠”、“民族瑰寶”［2，3］。

黃酮類化合物是植物中分布最廣泛的一類物質(zhì)，具有多種生理和藥理活性:可以防治心腦血管系統(tǒng)疾病和呼吸系統(tǒng)疾病，具有鎮(zhèn)痛作用、抗凝血作用、利膽及保肝作用、抗氧化作用、抗病毒、抗癌作用等;具有對神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)的作用、對消化系統(tǒng)的作用等［4，5］。已有研究表明，黃山貢菊中含有豐富的黃酮類化合物。因此，對黃山貢菊中黃酮類化合物成分進行生物學(xué)活性評價等方面的研究具有重要的意義。

實驗采用乙醇回流法從黃山貢菊中提取粗黃酮，以聚酰胺柱層析進一步純化，真空冷凍干燥獲得黃酮粉末，對受試組小鼠灌胃給予不同劑量的貢菊黃酮和聯(lián)苯雙脂，測定GPT/ALT、GOT/AST、MDA、SOD 值變化，對比不同劑量貢菊黃酮保肝效果，并對各組小鼠肝左葉石蠟進行切片及HE 染色，觀察其病理學(xué)效應(yīng)，研究貢菊黃酮的保肝作用。

1 材料與方法

1.1 材料

貢菊菊粉由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)實驗室提供，經(jīng)處理成粉末狀，120 ℃烘干備用。

四周齡ICR 雄性小鼠(體重20 ±2 g)，由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院提供。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

UV-1600 紫外可見分光光度計(北京瑞利分析儀器公司);HL-2S 恒流泵(上海青浦滬西儀器廠);自動部分收集器(上海青浦滬西儀器廠);TH-500A梯度混合器(上海滬西分析儀器廠);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52(上海亞榮生化儀器廠);722S 型分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司);冷凍干燥機(北京德天佑公司);輪轉(zhuǎn)式(SHANDONAS25)切片機;生物顯微鏡(model microscope BM2000)。

1.2.2 試劑

聚酰胺:浙江臺州市路橋四青生化材料廠，蘆丁:中國藥品生物制品檢定所，丙二醛(MDA)試劑盒:南京建成生物工程研究所，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒:南京建成生物工程研究所，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT/ALT)試劑盒及谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT/AST)試劑盒:長春匯力生物技術(shù)有限公司，氯仿、乙醇、HAc、NaOH、二甲苯、蘇木精、石蠟等均為國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 蘆丁標準曲線的繪制

準確吸取0.10 mg/mL 蘆丁標準液0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL、加30% 乙醇溶液至5 mL，再加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，震蕩后放置5 min，加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min，加1.0 mol/L NaOH 溶液2 mL，30%乙醇定容至10 mL，搖勻，以零管為空白，510 nm 測定吸光度。以蘆丁含量(μg)為橫坐標，吸光度為縱坐標作標準曲線:Y=0.001X-0.0017，R2=0.998。

1.3.2 回流法粗提貢菊黃酮

參照文獻方法，有改動［6，7］。稱取干燥的貢菊粉末，以濾紙包裹，放入250 mL 燒瓶并加入150 mL 70%乙醇，80 ℃水浴回流提取2 h。提取液減壓抽濾，并對濾液減壓蒸餾至呈無醇味。濾液于分液漏斗中分別以等體積氯仿、1/2 體積氯仿、1/3 體積氯仿進行三次萃取，收集上層水溶液，待聚酰胺層析純化。

1.3.3 貢菊黃酮的聚酰胺層析純化

1.3.3.1 裝柱與預(yù)處理

聚酰胺常規(guī)處置與常規(guī)裝柱。以3～4 倍柱體積的95%乙醇洗脫，至洗脫液透明，再依次用2～2.5 倍體積的5%NaOH 溶液、1 倍體積的蒸餾水、2～2.5 倍體積的10%HAc 溶液洗脫，最后用蒸餾水洗脫至pH 中性備用。

1.3.3.2 加樣、洗脫與收集

常規(guī)加樣。蒸餾水1 mL/min 洗脫至無色。加入70%乙醇溶劑洗脫，待洗脫下來的液體帶有醇味時，隔5 min 用FeCl3溶液檢驗，待洗脫液與FeCl3反應(yīng)呈綠色全自動部分收集器開始收集(1 管/5 min)，待洗脫液與FeCl3反應(yīng)不顯綠色時停止收集。

1.3.3.3 洗脫曲線的繪制

每隔4 管取1 管，按1.3.1 方法測吸光度，繪制洗脫曲線。

1.3.4 貢菊黃酮及蘆丁紫外吸收光譜

取貢菊黃酮水溶液及蘆丁溶液，190～600 nm進行掃描，以蒸餾水為空白對照。

1.3.5 貢菊黃酮抗小鼠急性肝損傷作用的研究

1.3.5.1 小鼠急性肝損傷模型的構(gòu)建

將ICR 小鼠分成兩組，10 只小鼠注射0.15 mL的豆油溶液，其它小鼠注射0.15 mL 2%CCl4豆油溶液。禁食12 h 后采血測所有小鼠(GPT/ALT)含量，取造模成功小鼠。

1.3.5.2 實驗小鼠分組及處理

將造模成功小鼠隨機分為空白對照組、肝損傷模型組、陽性對照組、黃酮低劑量組、黃酮高劑量組，共計5 組。按黃酮低劑量組、黃酮高劑量組、陽性對照組分別給予5 mg/mL 低劑量黃酮溶液、15 mg/mL高劑量黃酮溶液、聯(lián)苯雙脂灌胃，空白對照組、肝損傷模型組給予等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)8 d，劑量均為每只0.2 mL。第8 d 灌胃給藥1 h 后，空白對照組腹腔注射0.15 mL 10 mg/mL 豆油溶液，肝損傷模型組、黃酮給藥組、陽性對照組腹腔注射0.15 mL 2% CCl4豆油溶液。禁食12 h 后，黃酮組、陽性對照組分別給予相應(yīng)劑量黃酮液和聯(lián)苯雙脂灌胃，模型組和空白對照組等量生理鹽水灌胃。30 min 后，測定相關(guān)指標。

1.3.5.3 小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT/ALT)及谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT/AST)活性的測定

摘除小鼠眼球取血，3000 rpm 離心5 min，得上清即血清。按試劑盒說明書測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT/ALT)活性、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT/AST)活性。

1.3.5.4 小鼠肝組織丙二醛(MDA)含量的測定

按試劑盒說明書操作，計算組織中MDA 含量。

1.3.5.5 小鼠肝組織超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定

小鼠頸椎脫臼處死，解剖，肝臟置于冷生理鹽水中，濾紙吸干水分，按1∶9(質(zhì)量體積比)加入生理鹽水，冰浴研磨至漿狀。3000 rpm 離心10 min，上清液按試劑盒說明書測定SOD 活性。

1.3.5.6 小鼠肝組織的石蠟切片與HE 染色

取1.3.5.2 中處理后小鼠肝臟左葉切一組織塊，立即置于標本5 倍總體積的10%中性甲醛中，25 ℃固定48 h，梯度乙醇(30%乙醇-無水乙醇)脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋切片，HE 染色，光學(xué)樹脂封片，光鏡下觀察、拍照研究肝臟組織學(xué)病理改變。

1.4 數(shù)據(jù)處理以及分析

實驗數(shù)據(jù)通過DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行統(tǒng)計分析，利用EXCEL 2003 進行作圖。

2 結(jié)果與分析

圖1 聚酰胺層析純化黃酮洗脫曲線Fig.1 The elution curve of flavonoids by column chromatography of polyamide

2.1 聚酰胺層析純化貢菊黃酮

聚酰胺層析純化乙醇回流法從黃山貢菊中提取的粗黃酮，并按1.3.1 檢測純化過程，得黃山貢菊黃酮聚酰胺層析純化洗脫曲線如圖1 所示。從圖1 中可以看出，經(jīng)聚酰胺層析后，在1000 mL 洗脫液以內(nèi)時，貢菊黃酮分布相對集中，在約150 mL 和300 mL處出現(xiàn)貢菊黃酮洗脫最大值，其后，隨著洗脫的進行，貢菊黃酮含量逐漸減少，至1000 mL 以后黃酮含量達到極低值。

2.2 貢菊黃酮提取液紫外吸收光譜

圖2 貢菊黃酮和蘆丁標品紫外吸收光譜Fig.2 UV absorption spectrum of flavonoids and rutin standard

大多數(shù)黃酮類化合物的紫外光譜中均有兩個主要的吸收峰組成，分別在240 nm～280 nm 范圍內(nèi)(帶Ⅱ)和300 nm～400 nm 范圍內(nèi)(帶Ⅰ)，但不同類型黃酮化合物的帶Ⅰ或帶Ⅱ峰位、峰形和吸收強度存在一定不同。以蘆丁和貢菊黃酮提取液紫外吸收光譜對比研究，可得圖2。從圖2 可以看出，蘆丁標準溶液在212、261、356 nm 處共有三處吸收峰，而黃山貢菊黃酮分別在204、326 nm 集中出現(xiàn)兩處吸收峰。因此，貢菊黃酮的紫外吸收峰性質(zhì)符合天然黃酮類化合物的紫外吸收峰特征。

2.3 貢菊黃酮抗小鼠急性肝損傷的作用

2.3.1 貢菊黃酮對小鼠血清(GPT/ALT)活性的影響

表1 貢菊黃酮對小鼠血清(GPT/ALT)活性的影響(n=7，)Table 1 Effect of flavonoids from C.Morifolium cv.Gongju on GPT/ALT activity(n=7，)

表1 貢菊黃酮對小鼠血清(GPT/ALT)活性的影響(n=7，)Table 1 Effect of flavonoids from C.Morifolium cv.Gongju on GPT/ALT activity(n=7，)

注:a，P ＜0.05，b，P ＜0.01，差異顯著，與肝損傷模型組比較。Note:a，P ＜0.05，b，P ＜0.01，compared with liver injury group.

谷丙轉(zhuǎn)氨酶，即GPT/ALT，主要存在于肝細胞漿內(nèi)，被世界衛(wèi)生組織推薦為肝功能損害最敏感的檢測指標。作為目前最常用的肝功能指標，GPT/ALT 升高的程度與肝細胞受損的程度相一致。貢菊黃酮對小鼠血清(GPT/ALT)活性的影響見表1。從表1 可以看出，肝損傷模型組的小鼠血清(GPT/ALT)酶活高于空白對照組，達1%極顯著水平，說明實驗小鼠經(jīng)腹腔注射CCl4后，造成小鼠肝細胞的損傷，引起血清中的(GPT/ALT)含量上升。黃酮低劑量組小鼠血清(GPT/ALT)酶活低于肝損傷模型組，證明貢菊黃酮對于抗小鼠肝損傷有一定效果，但作用不顯著;黃酮高劑量組小鼠血清的(GPT/ALT)活性明顯低于肝損傷模型組，且作用顯著，達1%極顯著水平，說明貢菊黃酮劑量的增加可以逐步增強抗小鼠肝損傷的效果。

2.3.2 貢菊黃酮對小鼠血清(GOT/AST)活性的影響

表2 貢菊黃酮對小鼠血清(GOT/AST)活性的影響(n=6，)Table 2 Effect of flavonoids from C.Morifolium cv.Gongju on GOT/AST activity(n=6，)

表2 貢菊黃酮對小鼠血清(GOT/AST)活性的影響(n=6，)Table 2 Effect of flavonoids from C.Morifolium cv.Gongju on GOT/AST activity(n=6，)

注:a，P ＜0.05，b，P ＜0.01，差異顯著，與肝損傷模型組比較。Note:a，P ＜0.05，b，P ＜0.01，compared with liver injury group.

谷草轉(zhuǎn)氨酶，即GOT/AST，又名天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，主要存在于肝細胞線粒體內(nèi)。當肝臟發(fā)生嚴重壞死或破壞時，將引起谷草轉(zhuǎn)氨酶在血清中濃度的偏高。貢菊黃酮對小鼠血清(GOT/AST)活性的影響見表2。從表2 可以看出，肝損傷模型組的小鼠血清(GOT/AST)酶活高于空白對照組，達1%極顯著水平，說明腹腔注射CCl4造成小鼠肝細胞的損傷，引起小鼠血清(GOT/AST)含量的上升。同時，陽性對照組和黃酮低劑量組的血清(GOT/AST)活性均高于肝損傷模型組，說明聯(lián)苯雙脂和低劑量貢菊黃酮灌胃處理均不能降低血清(GOT/AST)活性，而黃酮高劑量組處理后，(GOT/AST)酶活低于肝損傷模型組，但未達顯著水平，表明高劑量黃酮能夠一定程度上促進肝損傷小鼠(GOT/AST)水平的降低。

2.3.3 貢菊黃酮對肝組織MDA 含量和SOD 活性的影響

表3 貢菊黃酮對小鼠肝組織MDA 含量和SOD 活性的影響(n=6，)Table 3 Effect of flavonoids from C.Morifolium cv.Gongju on the content of MDA and SOD activity(n=6，)

表3 貢菊黃酮對小鼠肝組織MDA 含量和SOD 活性的影響(n=6，)Table 3 Effect of flavonoids from C.Morifolium cv.Gongju on the content of MDA and SOD activity(n=6，)

注:a，P ＜0.05，b，P ＜0.01，差異顯著，與肝損傷模型組比較。Note:a，P ＜0.05，b，P ＜0.01，compared with liver injury group.

丙二醛(MDA)是機體內(nèi)氧自由基代謝過程中產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，它可以反映該體系中脂質(zhì)過氧化自由基的存在及反應(yīng)的程度，是脂質(zhì)過氧化和細胞氧化損傷的重要檢測指標。貢菊黃酮對肝組織MDA 含量的影響見表3。由表3 看出，肝損傷模型組MDA 含量高于空白對照組，說明CCl4豆油溶液引起了小鼠肝臟內(nèi)氧自由基水平的上升，發(fā)生了脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。與肝損傷模型組相比，黃酮低劑量組、黃酮高劑量組與陽性對照組的小鼠肝組織MDA 含量均有下降，表明貢菊黃酮對降低氧自由基具有一定效果，但黃酮低劑量組作用不顯著，黃酮高劑量組達5%顯著水平，說明高劑量貢菊黃酮可以降低氧自由基水平、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，具有較為明顯的抗肝損傷作用。

SOD 是廣泛存在于需氧生物體內(nèi)的一種金屬酶，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)，是體內(nèi)脂質(zhì)氧化的敏感指標，能催化超氧陰離子自由基產(chǎn)生歧化反應(yīng)，可抑制黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)化為黃嘌呤氧化酶，減少體內(nèi)自由基的產(chǎn)生，減輕肝細胞損傷程度［8-10］。由表3 可以看出，肝損傷模型組SOD 活力水平明顯低于空白對照組，說明CCl4損傷小鼠肝細胞，造成SOD 活性的降低。貢菊黃酮低劑量組和高劑量組肝組織SOD 活性均高于肝損傷模型組，表明貢菊黃酮具有提高小鼠肝組織SOD 活性，清除超氧陰離子自由基的能力，但未達顯著水平。同時，由表3 可以發(fā)現(xiàn)，聯(lián)苯雙脂對于提高肝臟細胞SOD 活力沒有效果。

2.3.4 貢菊黃酮對急性化學(xué)性肝損傷小鼠肝臟病理組織學(xué)的影響

貢菊黃酮對急性化學(xué)性肝損傷小鼠肝臟病理組織學(xué)的影響結(jié)果見圖3。從中可以看出，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，空白對照組小鼠肝組織的結(jié)構(gòu)正常，肝細胞形態(tài)正常，排列整齊，且基本無炎性細胞浸潤;急性肝損傷模型組小鼠的肝細胞腫脹，細胞膜破裂，結(jié)構(gòu)不完整，胞漿呈疏松化，核深染，可見明顯的點狀和灶狀壞死。與肝損傷模型組相比，貢菊黃酮低、高劑量組和聯(lián)苯雙酯陽性對照組肝臟組織細胞結(jié)構(gòu)較為完整，基本正常，損傷明顯減少，壞死和炎性細胞浸潤明顯減少。

圖3 化學(xué)性肝損傷小鼠肝臟病理組織學(xué)切片F(xiàn)ig.3 Histopathology of biopsies of mice with chemical liver injury

3 討論與結(jié)論

四氯化碳慢性肝損傷模型是研究抗肝炎藥物保肝作用的一個常用的動物模型，其主要是CCl4進入機體后，經(jīng)肝臟細胞色素P450 代謝為三氯甲基自由基攻擊肝臟生物大分子，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，引起肝細胞損傷，導(dǎo)致血清中ALT、AST 釋出升高［9，10］。

本研究采用乙醇回流法從黃山貢菊中提取粗黃酮，聚酰胺柱層析純化，真空冷凍干燥獲得黃酮粉末，對以四氯化碳造模的急性肝損傷小鼠分別給予聯(lián)苯雙酯及不同劑量的貢菊黃酮灌胃，測定了血清中GPT/ALT、GOT/AST 活性，測定了肝組織中SOD活性和丙二醛含量，HE 染色觀察肝組織病理形態(tài)學(xué)的改變，實驗結(jié)果表明，黃山貢菊黃酮可以降低急性肝損傷小鼠血清中GPT/ALT、GOT/AST 活性，提高肝組織SOD 活性，降低丙二醛含量，可不同程度地改善肝臟病理組織損傷。

聯(lián)苯雙酯是治療病毒性肝炎和藥物性肝損傷引起轉(zhuǎn)氨酶升高的常用藥物，可減輕因四氯化碳所致的肝臟損害和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT/ALT)升高，對四氯化碳所致的肝臟微粒體脂質(zhì)過氧化、四氯化碳代謝轉(zhuǎn)化為一氧化碳有抑制作用，并降低四氯化碳代謝過程中還原型輔酶Ⅱ及氧的消耗，從而保護肝細胞生物膜的結(jié)構(gòu)和功能。比較貢菊黃酮和聯(lián)苯雙脂的用藥效果可以發(fā)現(xiàn)，聯(lián)苯雙脂對(GPT/ALT)和MDA作用明顯，而貢菊黃酮不僅能降低血清(GPT/ALT)和(GOT/AST)活性，減少肝組織MDA 含量，還能提高肝組織SOD 活性。

因此，貢菊黃酮對抗小鼠急性肝損傷作用有明顯藥理學(xué)效果，具有良好的保肝作用，其作用機理可能與提高清除自由基酶的活性、增強機體清除自由基能力、減少自由基引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、保護肝細胞、維持肝細胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整性等有關(guān)。貢菊黃酮的研究對保肝藥物的研發(fā)具有重要意義。

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