層孔菌屬真菌抗氧化活性物質測定及抗氧化能力分析

謝麗源，彭衛紅，黃忠乾，譚 偉，甘炳成

四川省農業科學院土壤肥料研究所，成都 610066

鮑氏層孔菌(Phellinus baumii)、裂蹄針層孔菌(Phellinus linteus)、松木層孔菌(Phellinus pim)是屬于銹革孔菌科(Hymenochaetacae)、針層孔菌屬(Phellinus)的藥用真菌，均屬于是中藥桑黃的來源菌，是珍稀的藥用真菌［1］。研究表明，這三種層孔菌具有抗腫瘤、增強免疫、抗氧化、降血糖等功效，是目前國際公認的生物抗癌領域中藥效非常好的藥用真菌［2，3］。研究發現，大型真菌具有較高的抗氧化活性，是開發天然、安全、高效的天然抗氧化劑的理想材料。

目前體外抗氧化能力的測定方法比較多，這些方法與操作難易程度、生物相關性、反應機理、反應發生環境等相關。但是不論是哪種方法都各有利弊，目前為止，沒有一種方法可以代替全部的方法而作為標準方法用于所有復雜抗氧化劑的評價，更沒有一種方法可以模擬生物體內的復雜環境。大多數的學者，在研究抗氧化能力時，使用一種或同時使用不同機理的兩種或三種方法來共同評價物質的抗氧化能力。然而，不同方法得出的結論并不一定都是一致的，有的甚至會得出相反的結論。由于方法的不統一使得目前有關抗氧化作用的研究十分混亂。因此，必須同時使用多種方法進行測定，評價不同方法間的相關性，建立多種方法的數據庫，為抗氧化活性研究提供參考標準，并為栽培、育種以及產品開發提供理論依據。

本研究以層孔菌屬真菌中鮑氏層孔菌、裂蹄針層孔菌、松木層孔菌作為研究材料，利用多種抗氧化測定方法，對三種真菌不同菌株的抗氧化成分進行系統評價和比較，揭示三種層孔菌在抗氧化方面的藥用價值，為其抗氧化機理研究以及進一步的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株

鮑氏層孔菌:H2、H3、H6、H8、H9;裂蹄針層孔菌:H1、H5、H7、H10、H11、H12;松木層孔菌:H4、X、L、S、P。以上菌株均由四川省微生物研究開發中心提供，并經過分子鑒定。

1.2 試劑

DPPH:Sigma 公司;葡萄糖、無水乙醇、冰乙酸、乙酸乙酯、苯酚、過氧化氫、硫酸亞鐵、水楊酸、鄰苯三酚、鹽酸、磷酸鹽緩沖液、鐵氫化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、甲醇等均為分析純，成都長征生物試劑公司提供。

1.3 儀器

紫外分光光度計UV1240:日本島津儀器公司;GLI66-Ⅱ高速離心機:上海安亭科學儀器廠;HH.S11-Ni6-列六孔恒溫水浴鍋:北京長安科學儀器廠;ALC-Z10.3 電子天平:北京賽多利斯天平有限公司;R-201 旋轉蒸發器:上海申勝生物技術有限公司;SHB-Ⅲ循環水多用真空泵:鄭州長城科工貿有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 液體發酵培養基

葡萄糖30 g/L，蛋白胨20 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO4.7H2O 1 g/L，pH 自然。

1.4.2 發酵液制備

接種10%液體種子培養基(PDA)于裝液量為120 mL 發酵培養基(500 mL 三角瓶)中，培養溫度26 ℃，轉速120 rpm，培養7 d，過濾，收集發酵液，備用。

1.4.2 多糖含量測定

參考張惟杰方法［4］，以葡萄糖作為標準品，繪制標準曲線，求出回歸方程(Y=0.0147X+0.0081，R2=0.9968)。發酵液適當稀釋后，取2 mL 加入5%苯酚1 mL，5 mL 濃硫酸，反應20 min 后，在490 nm 波長測定吸光度，將所得的光吸收值代入回歸方程，得到多糖含量。

1.4.3 總酚含量測定

以沒食子酸作為標準品，按照福林-肖卡法［5］，繪制標準曲線，得回歸方程(Y=0.1359X +0.0141，R2=0.9983)。樣品溶液0.2 mL 于10 mL 容量瓶，再加入1 mL 福林酚顯色劑，搖勻后靜置5 min，再加入2 mL 15% Na2CO3溶液，定容至10 mL，室溫下反應2 h 后，在760 nm 波長測定吸光度。將所得的光吸收值代入回歸方程，得到總酚含量。

1.4.4 黃酮含量測定

以蘆丁作為標準品，按照蘆丁-AlNO3法［6］繪制標準曲線，得回歸方程為(Y=0.009X-0.0006，R2=0.9994)。精密量取樣品液1 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，使混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉試液10 mL，再加水至25 mL 刻度，搖勻，放置15 min，在510 nm的波長處測定吸收度。將所得的光吸收值代入回歸方程，得到黃酮含量。

1.4.5 還原力測定［7］

取1 mL 不同濃度的待測液與2.5 mL 0.2 mol/L pH6.6 的磷酸鹽緩沖液及2.5 mL 1%鐵氰化鉀混合，混合物混勻后50 ℃水浴保溫20 min，然后加入2.5 mL 10% (W/V)三氯乙酸，4000 rpm 離心10 min。取上清液2.5 mL，分別加入2.5 mL 蒸餾水和0.5 mL 0.1%FeCl3混勻，靜置10 min，以蒸餾水代替FeCl3溶液作為空白調零，于700 nm 處測定吸光度。

1.4.6 對超氧陰離子自由基(O-·2)清除作用研究［8］

采用鄰苯三酚自氧化法。取4.5 mL 50 mmol/L pH 8.2 的Tris-HCl 緩沖液，4.2 mL 蒸餾水，混勻后在25 ℃水浴中保溫20 min，取出后立即加入25 ℃預熱過的3 mmol/L 鄰苯三酚(由10 mmol/L HCl 配制)0.3 mL，迅速搖勻后倒入比色杯，空白管用10 mmol/L HCl 代替鄰苯三酚，325 nm 下每隔30 s 測定吸光值，計算線性范圍內每分鐘吸光度的增加。多糖清除作用是在加入鄰苯三酚之前，加入不同濃度的多糖溶液，在相同波長處測定吸光度，計算抑制率。

式中:△A0/△t表示鄰苯三酚自氧化反應速率，△Ai/△t表示加入多糖樣品液后鄰苯三酚自氧化反應速率。

1.4.7 對羥自由基(·OH)的清除作用研究［9］

9 mmol/L FeSO41 mL，9 mmol/L 水楊酸-乙醇1 mL，不同濃度的待測溶液1 mL，8.8 mmol/L H2O21 mL 最后加入混勻并啟動整個反應。37 ℃反應0.5 h 后，4000 rpm 離心10 min，然后以蒸餾水作為空白，在510 nm 下測定吸光度。以上混合溶液中以蒸餾水代替H2O2作為待測溶液的本底吸收值。

式中:A0為空白對照液的吸光度，Ax為加入待測溶液后的吸光度，Ax0為不加顯色劑H2O2待測溶液的本底吸收值。

1.4.8 對DPPH 自由基清除作用研究［10］

95%的甲醇溶解4 mg DPPH 并定容到100 mL。將1 mL 不同濃度的待測液與3 mL DPPH 溶液分別加入試管中，搖勻，室溫靜置20 min，以1 mL 不同濃度的待測液與3 mL 95%甲醇溶液作為空白，于517 nm 處測定吸光度Ai。以1 mL 95%甲醇與3 mL DPPH 溶液混合后溶液的吸光度Aj 為對照。

1.4.9 鐵離子螯合能力測定［11］

分別取1 mL 各種樣品溶液，加入0.1 mL 2 mmol/L 氯化亞鐵中，混勻后，加入0.2 mL 5 mmol/L Ferrozine，混勻，然后室溫下靜置20 min，最后加入3.7 mL 55%乙醇，于562 nm 處測定吸光度A1，不加樣品，以蒸餾水補足，同上操作處理，測定其對比吸光度A0;以55%乙醇作為空白對照，根據下面公式計算鐵離子鰲合能力:

鐵離子鰲合能力(%)=［(A0-A1)/A0］×100

2 結果與分析

2.1 活性物質含量分析

2.1.1 粗多糖含量分析

對不同層孔菌屬真菌粗多糖含量進行分析，結果表明(圖1)，H2 菌株粗多糖含量顯著高于其他菌株(P ＜0.05 或P ＜0.01);而H8、H6、H7、X、L、P 菌株的粗多糖含量次之(P ＜0.01 或P ＜0.05);H1、H4、H5、H3、H9、H10、H11、H12、S 菌株粗多糖含量較低(P ＜0.01)，且各菌株間沒達到顯著差異。

圖1 不同菌株粗多糖含量比較Fig.1 Comparison of polysaccharide content of different strains

2.1.2 黃酮含量分析

對不同菌株黃酮含量進行分析，其結果如圖2所示，菌株S 的黃酮含量顯著高于其余菌株(P ＜0.01);菌株H2、H4、H8、P 黃酮含量次之;菌株H5、H6、H7、H9、H10、H11、H12、L、X 黃酮含量較低;而菌株H1、H3 的黃酮含量顯著低于其他菌株(P ＜0.01 或P ＜0.05)。

圖2 不同菌株黃酮含量比較Fig.2 Comparison of flavonoids content of different strains

2.1.3 總酚含量分析

對不同菌株總酚含量進行比較，研究結果表明(圖3)，菌株H2 的總酚含量顯著高于其他菌株(P＜0.01 或P ＜0.05)，菌株H4、H7、H9、S、L 總酚含量次之，菌株H5、H6、H8、H10、H11、P 的總酚含量相當，而菌株H1、H3、H12、X 的總酚含量較低，顯著低于其他菌株(P ＜0.01)，且之間未達到顯著差異。

圖3 不同菌株總酚含量比較Fig.3 Comparison of phenolic content of different strains

2.2 抗氧化能力測定

2.2.1 還原力研究

抗氧化劑是通過自身的還原作用給出電子而清除自由基，抗氧化劑的還原力與其抗氧化活性之間存在關系，還原力越強，抗氧化活性越強。具有還原能力的物質作為電子供體，能夠還原脂質過氧化過程中的中間氧化產物，從而具備抗氧化性能，因此物質的還原能力可以看作其潛在的抗氧化性能的重要體現。由圖4 可知，不同菌株具有不同程度的的還原能力，但其還原力高低有顯著差異。菌株H2 還原能力最強(P ＜0.01);菌株H4、H7、H9、H10、L、P的還原能力相當，未達到顯著差異(P ＞0.05)，還原能力僅次于H2;菌株H8、H11、X 還原能力再次之;菌株H3、H5、H6、H12、S 還原能力較低，僅高于H1(P ＜0.01);而菌株H1 還原能力顯著低于其余菌株(P ＜0.01)。

圖4 不同菌株間還原力比較Fig.4 Comparison of reducing power of different strains

2.2.2 羥自由基清除作用研究

羥自由基是對機體危害最大的自由基，會造成組織脂質過氧化，蛋白質解聚與聚合，核酸斷裂、多糖解聚，其反應速度快，是已知化學性質最活潑的活性氧自由基，羥自由基清除率是反應藥物抗氧化作用的重要指標［12］。從圖5 可知，各菌株對羥自由基具有一定程度的抑制作用，其中菌株H2 和H9 對羥自由基清除作用最強(P ＜0.01)，兩者之間沒有顯著差異;菌株H10、H11、X、L、P 對羥自由基的清除作用次之;而菌株H1、H3、H6、H12、S 的清除作用低于其余菌株(P ＜0.01 或P ＜0.05)。

圖5 不同菌株間羥自由基清除能力比較Fig.5 Comparison of hydroxyl radical scavenging capacity of different strains

2.2.3 超氧自由基清除作用研究

由圖6 可知，供試菌株對超氧自由基均有不同程度的清除作用，菌株H2、H5、H8、H9 對超氧自由基清除作用最強(P ＜0.01)，且菌株間顯著性不明顯;接下來清除作用從高到低依次是菌株H4、P、L、H10、H1、H6、H3;菌株X、H7、S、H11 清除作用顯著低于以上菌株(P ＜0.01)，且菌株間沒有達到顯著差異;而菌株H12 的清除作用最低(P ＜0.01)。

圖6 不同菌株超氧自由基清除率比較Fig.6 Comparison of superoxide radical scavenging capacity of different strains

2.2.4 鐵離子螯合能力研究

對層孔菌屬真菌鐵離子螯合能力研究發現，不同菌株具有不同的鐵離子螯合能力(圖7)，菌株H2具有最高的鐵離子螯合能力(P ＜0.01)，隨后鐵離子螯合能力按照菌株L、H9、S、H8、H4、P、H7、H10、H6、H11、X、H5 依次遞減，而菌株H1、H3、H12 的螯合能力較低，在5%和1%水平均未達到顯著水平。

圖7 不同菌株鐵離子螯合能力比較Fig.7 Comparison of Fe chelating ability of different strains

圖8 不同菌株DPPH 自由基清除能力比較Fig.8 Comparison of DPPH radical scavenging capacity of different strains

2.2.5 DPPH 自由基清除作用研究

對層孔菌屬真菌DPPH 自由基清除能力進行研究，研究結果表明(圖8)，H2、L 菌株的DPPH 自由基清除能力高于其余菌株(P ＜0.01 或P ＜0.05);菌株H4、P、H7、H9、H10 次之，但清除能力相差不大;隨后依次為菌株X、H8、H6、H5、H11;菌株S、H12、H3 清除作用較低，僅高于H1;而H1 清除能力顯著低于其余菌株(P ＜0.01)。

2.3 相關性分析

2.3.1 不同測定方法間的相關性

不同的體外評價抗氧化能力方法所得結果間，具有不同的統計學相關性。從表1 中可以看出，羥自由基與DPPH 自由基(R=0.831)、鐵離子螯合能力(R=0.845)及還原力(R=0.801)方法間達到了極顯著相關(P ＜0.01);DPPH 自由基與鐵離子螯合能力(R=0.913)和還原力(R=0.910)方法間達到了極顯著相關(P ＜0.01);鐵離子螯合能力與還原力方法間達到了極顯著相關，相關系數為0.898(P＜0.01)。而超氧陰離子自由基與DPPH、羥自由基、鐵離子螯合能力及還原力方法間沒有顯著的相關性，相關系數分別為0.389、0.531、0.436、0.354(P ＞0.05)。由此說明，不同的體外評價抗氧化能力方法所得結果間，具有不同的統計學相關性。現有的數據統計結果表明，不能用一種評價方法所得的結果來概況其他評價方法的結果，而應盡量選擇多種抗氧化評價方法，較全面、客觀的評價被評價化合物的抗氧化能力。

表1 不同抗氧化方法間的相關性Table 1 Linear correlation coefficients among different methods for testing antioxidant capacity

2.3.2 樣品活性組分含量相關性研究

對活性物質含量間相關性進行分析，由表2 可知，粗多糖含量與總黃酮和總酚含量相關系數分別為0.533 和0.531(P ＞0.05);而總黃酮含量與總酚含量達到了顯著相關，相關系數為0.777(P ＜0.05)。說明層孔菌屬真菌這三種主要活性物質含量間相關性不大，可以借鑒和參考，但是不同活性物質含量還應通過實際測量值為準，不能由一種活性物質含量來評價其他活性物質含量。

表2 活性物質含量間相關性Table 2 Correlation among active composition

注:* P ＜0.05。Note:* P ＜0.05.

2.3.3 抗氧化能力與抗氧化物質含量的相關性

為了弄清層孔菌屬真菌的抗氧化能力與酚類物質含量、黃酮類物質含量及粗多糖含量的關系，根據前面對不同菌株的總酚、總黃酮、粗多糖的含量測定結果及不同方法測得的抗氧化能力結果作了相關性分析(表3)。由此可知，層孔菌屬真菌的總酚、總黃酮及粗多糖含量與不同方法測得的抗氧化能力大多呈顯著相關。總酚含量與對羥自由基、DPPH 自由基、鐵離子螯合能力及還原力方法測得的抗氧化能力間的相關系數分別達到了0.840、0.943、0.924、0.917(P ＜0.01);總黃酮含量與DPPH 自由基、鐵離子螯合能力及還原力方法測得的抗氧化能力間的相關系數分別達到了0.810(P ＜0.01)、0.725、0.738(P ＜0.05);粗多糖含量與鐵離子螯合能抗氧化能力間的相關系數為0.653(P ＜0.05)，由此說明總酚與抗氧化能力有最高的相關性，充分證明多酚類物質是抗氧化作用的重要因子，對抗氧化能力具有重要貢獻，除此之外，黃酮類物質與各抗氧化測定方法間的相關系數次之，說明也對抗氧化作用作出一定貢獻，而粗多糖與其相關系數較低，因此說明，層孔菌屬的抗氧化能力貢獻主要來自總酚類和黃酮類物質。

表3 抗氧化能力與抗氧化物質含量的相關性Table 3 Linear correlation coefficients between antioxidant composition and antioxidant capacity

3 結論與討論

物質抗氧化活性的評價方法包括很多種，目前還沒有統一的標準方法。抗氧化能力測定方法之所以仍沒有一個標準方法，主要原因在于:(1)生物體中存在多個抗氧化系統，他們的工作原理及相互間的關系尚未搞清楚，所以單一的測定方法很難對抗氧化物質進行綜合評價;(2)生物體中存在多種自由基和抗氧化劑，他們各自都有不同的化學和物理特征。某一抗氧化劑在單一系統中可能會同時具有多重機制，或者在不同系統中表現出不同的機制。此外對于不同的自由基，抗氧化劑的清除機制也不相同;(3)現在采用的抗氧化方法大多為體外抗氧化測定，無法真實模擬生理環境，且各方法都僅僅測定了抗氧化能力中的某一方面，故無法模擬生理條件下的多條抗氧化途徑;(4)測定的樣品大多為混合物，其成分十分復雜，各抗氧化物質的抗氧化作用無法用單一的機制來解釋。由于生物體內自由基的種類、產生機理、產生部位及它所作用的靶點的不同，相對應的抗氧化劑的抗氧化機理和能力就不同［13］。因此，通過體外抗氧化實驗篩選抗氧化劑需要采用多種自由基，選擇多種抗氧化評價方法，尤其是基于不同抗氧化機制的評價方法，利用多系統、多方面來全面、客觀的評價待測物的總抗氧化能力。針對對不同層孔菌屬真菌不同抗氧化能力測定，研究結果表明，菌株H2 還原力、鐵離子螯合能力最強，菌株H2 和H9 的對羥自由基清除作用最強，菌株H2 和L DPPH 自由基清除作用最強，菌株H2、H5、H8、H9 對超氧自由基清除作用最強，綜合分析發現，菌株H2 具有較高的抗氧化能力，但其他菌株間在不同方法間存在較大差異。不同層孔菌屬真菌的抗氧化能力比較，不同方法間存在差異，各種方法測定的結果數值不一，表述方式不同，羥自由基與DPPH 自由基(R=0.831)、鐵離子螯合能力(R=0.845)及還原力(R=0.801)，DPPH 自由基與鐵離子螯合能力(R=0.913)和還原力(R=0.910)，以及鐵離子螯合能力與還原力(R=0.898)這幾種方法的相關性較高，測定結果較為一致。由此可見，不同的體外評價抗氧化能力方法所得結果間具有不同的統計學相關性，不能用一種評價方法所得的結果來概況其他評價方法的結果，而應盡量選擇多種抗氧化評價方法，較全面、客觀的評價被評價化合物的抗氧化能力。

對供試菌株的主要活性物質多糖、總酚、總黃酮含量測定結果表明，層孔菌屬真菌含量較為豐富的多糖、總酚和黃酮類物質，其中菌株H2 粗多糖和總酚含量最高，菌株S 黃酮含量最高。對活性物質含量間相關性進行分析發現，總黃酮和總酚含量間有顯著相關性，相關系數為0.777(P ＜0.05)，粗多糖含量與總黃酮及總酚含量間相關性稍低，相關系數分別為0.533 和0.531(P ＞0.05);說明層孔菌屬真菌這三種主要活性物質含量間相關性不大，可以借鑒和參考，因此不同活性物質含量還應通過實際測量值為準。

食用菌一直以其特有的食藥兼用性受到人們的青睞。近年來，食用菌的抗氧化作用開始日益受到關注，但大多數研究集中在粗多糖、純化多糖或粗提物的抗氧化活性，而對食用菌中不同活性成分的抗氧化性能研究較少，尤其是對食用菌中發揮抗氧化性能起主要貢獻的功能成分缺乏定論［8］。本研究針對抗氧化能力與抗氧化物質含量的相關性進行分析，層孔菌屬真菌的總酚、總黃酮及粗多糖含量與不同方法測得的抗氧化能力大多呈顯著相關。總酚含量與羥自由基、DPPH 自由基、鐵離子螯合能力及還原力方法測得的抗氧化能力間的相關系數分別達到了0.840、0.943、0.924、0.917(P ＜0.01);總黃酮含量與DPPH 自由基、鐵離子螯合能力及還原力方法測得的抗氧化能力間的相關系數分別達到了0.810(P ＜0.01)、0.725、0.738(P ＜0.05);粗多糖含量與鐵離子螯合能力間的相關系數為0.653(P ＜0.05)，說明總酚與抗氧化能力有最高的相關性，充分證明多酚類物質是抗氧化作用的重要因子，對抗氧化能力具有重要貢獻，總黃酮類物質與抗氧化能力相關性次之，說明對抗氧化能力貢獻弱于總酚類物質，而相比之下，粗多糖含量與抗氧化能力間相關系數較低，說明粗多糖對抗氧化能力的影響較低。

1 Zhang XQ(張小青)，Dai YC(戴玉成).Flora FungorumSinicorum(Vol 29，Hymenochaetaceae)(中國真菌志).Beijing:Science Press，2005.117-191.

2 Cho EJ，Hwang HJ，Kim SW，et al.Hypoglycemic effects of exopolysaccharides produced by mycelial cultures of two different mushrooms Tremella fuciformis and Phellinus baumii in ob/ob mice.App Microbiol Biotechnol，2007，75:1257-1265.

3 Song AR(宋愛榮)，Wang GY(王光遠)，He ZC(何忠誠)，et al.Immunological regulation of Phellinus igniarius crude polysaccharides to tumor bearing mice.Mycosystema(菌物學報)，2009，28:295-298.

4 Zhang WJ(張惟杰).Glycoconjugate Biochemical Research Techniques(糖復合物生化研究技術).Zhejiang:Zhejiang University Press，1999.309-320.

5 Jayaprakasha GK，Singh RP，Sakariah KK.Antioxidant activity of grape seed(Vitis vinifera)extracts on peroxidation models in vitro.Food Chem，2001，73:285-290.

6 Zhang J(張靜)，Yu JJ(余加進)，Dai JH(戴建輝)，et al.The determination of total flavonoids from Chinese herbal extracts.J Yunan Univ National(云南民族大學學報)，2010，19:414-416.

7 Kumaran A，Karunakaran RJ.Antioxidant and free radical scavenging activity of an aqueous extract of Coleus aromaticus.Food Chem，2006，97:109-114.

8 Xie LY(謝麗源)，Zhang Y(張勇)，Peng WH(彭衛紅)，et al.Immune function and antioxidant activity of intracellular polysaccharides from Phellinus baumii.Food Sci(食品科學)，2011，32:276-281.

9 Smironff N，Cumbers QJ.Hydroxyl radical scavenging activity of compatible solutes.Phytochemistry，1989，28:1057-1560.

10 Kumaran A，Karunakaran RJ.Activity-guided isolation and identification of free radical-scavenging components from an aqueous extract of Coleus aromaticus.Food Chem，2007，100:356-361.

11 Dinis TCP，Madeira VMC，Almeida LM.Action of phenolic derivates(acetaminophen，salicylate，and 5-aminosalicylate)as inhibitors of membrane liquid-peroxidation and as peroxyl radical scavengers.Arch Biochem Biophys，1994，315:161-169.

12 Du GR(杜國榮).Study on the total antioxidant capacity and bioactive compounds of kiwi，persimmon and apple fruits.Yangling:Northwest Agriculture and Forestry University(西北農林科技大學)，PhD.2009.