Neuropilin-1及VEGF在胃癌組織中的表達與微血管生成的關系

李 明 李 強

腫瘤血管生成及腫瘤抗血管生成治療是近年來腫瘤研究的熱點之一。神經纖毛蛋白-1（Neuropilin-1，NRP-1）在神經細胞導向、軸突生長方面發揮調節作用，最近發現可作為血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的協同受體，在腫瘤血管新生方面發揮重要作用。目前報道在許多腫瘤組織均有NRP-1的表達，包括前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、大腸癌和肺癌等［1-4］。本研究通過RT-PCR法檢測組織中NRP-1 mRNA和VEGF mRNA的表達，免疫組織化學法測定微血管密度（MVD），探討NRP-1、VEGF與血管生成及胃癌侵襲、轉移的關系和意義。

1 材料與方法

1.1 材料

收集本院2011年5月至2013年5月手術切除經病理確診的胃癌標本72例，相應癌旁正常胃組織72例，其中男性42例，女性30例，年齡42～75歲，中位年齡58歲。管狀腺癌50例，黏液腺癌15例，其他類型癌7例；高中分化腺癌52例，低分化腺癌20例；有淋巴結轉移48例，無淋巴結轉移24例。胃癌分期采用UICC2009版TNM分期標準，Ⅰ期7例，Ⅱ期19例，Ⅲ期31例，Ⅳ期15例。所有標本均經本院倫理委員會同意，取得患者或家屬的知情。所有病例術前均未接受過放、化療，免疫治療及中醫中藥治療。

1.2 方法

1.2.1 取材及制片 所取標本均取自手術中標本離體后10 min內完成取材，每例手術標本均取癌灶和相應正常組織各4塊，每塊約200～300 mg，裝入無酶Eppendorf（EP）管中，并立即投入液氮中深凍，遂轉至-70℃冰箱保存備用。每個標本另取兩管以4%的多聚甲醛固定48～72 h，自來水充分沖洗后梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋，4 μm連續切片。

1.2.2 免疫組織化學SP法染色 CD105單克隆抗體及SP染色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。標本用甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續切片。嚴格參照說明書染色，抗體工作濃度為l∶200，使用高壓蒸汽修復，抗原修復液為pH 6.0檸檬酸緩沖液，磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗為陰性對照，以已知陽性片（公司提供）作為陽性對照。MVD計數參照Weidner等［5］的方法：以血管內皮細胞呈棕黃色染色為CD105陽性，微血管計數以被染成棕黃色的單個內皮細胞或內皮細胞簇作為1個血管計數。先在低倍鏡（×40）下選擇微血管密度最高的5個區域，然后在高倍鏡（×400）下計數這5個視野的微血管數并取其平均值（圖1）。

1.2.3 RT-PCR檢測 通用RT-PCR試劑盒購于北京百泰克生物技術有限公司，Trizol購于Invitrogen公司，B-actin引物購于武漢博士德生物技術公司。按Invitrogen公司Trizol試劑盒操作方法一次抽提總RNA，用紫外分光光度計測定核酸吸光度OD260和OD280值，測定組織總RNA純度和濃度；用隨機引物和逆轉錄酶合成cDNA鏈；引物軟件由武漢博士德生物技術公司設計合成，NRP-1上游引物為：5'-CGAAGGTGAAGGAGAAGGTG-3'下游引物為：5'-ACAGGCACAGTACAGCACGA-3'合成DNA序列片斷長度：151 bp。β-actin上游引物為：5'-CACCCCC ACTGAAAAAGATGA-3'下游引物為：5'-CATCTTCA AACCTCCATGACG-3'合成DNA片斷長度：326 bp。PCR反應體系（總體積25 μL）：H2O 16 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，10×buffer 2.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，Taq 酶 0.5 μL。PCR條件：預變性94℃，5 min；94℃，45 s；51℃，45 s；72℃，1 min；35個循環；延伸72℃，7 min。10 μL擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像分析儀進行分析，以內參強度值標化NRP-1和VEGR，得到各條帶與相應β-actin條帶的強度比值為最后表達值。各組結果以表示。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 NRP-1 mRNA、VEGF mRNA PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果

72例胃癌組織和相應的正常胃組織中可見NRP-1 mRNA、VEGF mRNA的表達，瓊脂糖凝膠電泳發現在151bp、152 bp處分別可見NRP-1RT-PCR產物和VEGF RT-PCR產物的清晰條帶，周圍無雜帶（圖2）。

圖1 胃癌組織和正常胃組織中CD105的表達 （SP×100）Figure 1 Expression of CD105 with immunohistochemical staining in gastric carcinoma and normal gastric tissues （SP×100）

圖2 NRP-1、VEGF RT-PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果Figure 2 NRP-1 and VEGF RT-PCR-amplified products by agarose gel electrophoresis

2.2 胃癌組織與癌旁正常組織中NRP-1 mRNA、VEGF mRNA的表達及MVD計數

72例胃癌組織中59例NRP-1 mRNA陽性表達，表達率81.94%，癌旁正常組織中2例NRP-1 mRNA表達，陽性表達率2.77%，二者有顯著性差異（χ2=100.016，P＜0.001）。45例VEGF mRNA陽性表達，表達率62.50%，癌旁正常組織中9例有VEGF mRNA表達，陽性表達率12.50%，二者有顯著性差異（χ2=37.924，P＜0.001）。59例胃癌組織中NRP-1 mRNA的表達水平為0.56±0.19，2例正常組織中NRP-1 mRNA表達水平為0.18±0.12，兩組間有顯著性差異（t=2.796，P=0.007）。45例胃癌組織中VEGF mRNA的表達水平為0.63±0.18，11例正常組織中NRP-1 mRNA表達水平為0.42±0.17，兩組間有顯著性差異（t=3.504，P=0.001）。胃癌組織測得的MVD值為14.27±3.28，正常組織中為9.34±1.26，兩組間有顯著性差異（t=11.906，P＜0.001，表1）。

2.3 胃癌組織中NRP-1 mRNA、VEGF mRNA的表達與臨床病理因素的關系

胃癌組織中NRP-1 mRNA的表達與腫瘤大小（t=2.238，P=0.028）、浸潤深度（t=-2.223，P=0.029）、淋巴結轉移（t=-2.077，P=0.041）呈正相關（P＜0.05）。胃癌組織中VEGF mRNA的表達與腫瘤分化程度（t=-2.341，P=0.022）、浸潤深度（t=-2.919，P=0.005）、淋巴結轉移（t=-2.594，P=0.012）呈正相關（P＜0.05，表2）。

2.4 胃癌組織中NRP-1 mRNA、VEGF mRNA的表達與MVD的關系

胃癌組織中NRP-1 mRNA與VEGF mRNA共同陽性表達者占43.06%（31/72），NRP-1 mRNA的表達與VEGF mRNA的表達呈正相關（r=0.58，P＜0.01）；NRP-1 mRNA的表達與MVD呈正相關（r=0.52，P＜0.01）；VEGF mRNA的表達與MVD呈正相關（r=0.74，P＜0.01，圖3）。

表1 胃癌組織及正常組織中NRP-1 mRNA、VEGF mRNA的表達及MVD計數Table 1 Expressions of NRP-1mRNA,VEGFmRNA,and MVD counts in gastric carcinoma and normal gastric tissues

表2 胃癌組織中NRP-1 mRNA、VEGF mRNA的表達與臨床病理因素的關系Table 2 Relationship among the expressions of NRP-1mRNA,VEGFmRNA,and clinical pathological factors in gastric carcinoma

圖3 胃癌組織中NRP-1 mRNA、VEGF mRNA的表達與MVD呈正相關Figure 3 Positive correlation among the expressions of NRP-1mRNA,VEGFmRNA,and MVD in gastric carcinoma

3 討論

目前研究表明血管生成促進因子（VEGF）可促進腫瘤血管生成，在腫瘤的侵襲和轉移生物學行為中發揮非常重要的作用。NRP-1是新近發現的VEGF受體，位于形成中的神經纖維軸突上，位于細胞表面，為Ⅰ型跨膜糖蛋白，在神經細胞導向、軸突生長方面發揮調節作用。正常成人NRP-1主要表達于內皮細胞、骨髓基質細胞、成骨細胞等。NRP-1可表達于大多數惡性腫瘤組織中，Ghosh等［6］觀察到，NRP-1在乳腺癌早期病變中可能與腫瘤生長及進展有關，并且在乳腺癌浸潤和轉移中起重要作用。Staton等［3］研究發現NRP-1在大腸癌組織中呈高表達，而在正常腸黏膜中微弱表達。Hansel等［7］研究表明，在消化道腫瘤發展過程中，隨著腺體的發育異常從低到高，癌前病變組織中NRP-1表達強度和范圍隨之增加，食管、胰腺、結直腸癌中NRP-1的表達水平與癌浸潤及轉移程度呈正相關，提示NRP-1可能與消化道腫瘤的發生和發展有關。本研究發現胃癌組織中NRP-1、VEGF表達主要位于癌細胞胞膜上和胞質內，其表達陽性率明顯高于正常胃黏膜組織，且表達與胃癌的浸潤深度、淋巴結轉移存在密切相關性，說明NRP-1和VEGF參與了胃癌的進展過程。

MVD是反映腫瘤組織血管生成狀態的良好指標，目前已廣泛應用于腫瘤血管生成的研究。使用免疫組織化學技術對血管內皮細胞進行標記。CD105是近年來發現的內皮細胞增殖的標志物，僅在處于增殖狀態的腫瘤組織血管內皮細胞上強表達［8］，在大血管及正常組織中表達較弱或不表達。在許多惡性腫瘤中均有表達，通過一系列機制促進腫瘤生長［9］。MVD早期的研究發現腫瘤微血管密度與惡性腫瘤組織學特征及一些生物學特性間都有密切的關系，Carvalho等［10］在乳腺癌中的研究發現MVD高的乳腺癌患者其遠處轉移的機會明顯增加，其它的一些研究也顯示隨著MVD的增加，腫瘤的生成、侵襲和轉移都明顯增加［11］。本研究結果與上述報道一致，胃癌組織中MVD值明顯高于正常胃黏膜組織，浸透漿膜組高于未及漿膜組，淋巴結轉移組高于無轉移組，提示腫瘤內新生血管越豐富，越容易發生侵襲及轉移。

NRP-1在腫瘤中的作用機制非常復雜，Dvora等［12］發現在腫瘤組織中，NRP-1不僅表達于腫瘤細胞中，還表達于血管內皮細胞中，提示NRP-1可能在這兩個不同的部位都發揮著作用。在內皮細胞中，NRP-1作為協同受體，可增強VEGF165與VEGFR-2的結合，結合物能顯著增加VEGFR-2的活性，促進VEGF與VEGFR-2的結合，加強VEGF165誘導的內皮細胞趨化性及有絲分裂原性，從而促進腫瘤血管生成［13］。由于部分腫瘤細胞中無VEGFR-2的表達，NRP-1在腫瘤細胞中的作用也可能通過直接與VEGF結合或其他信號傳導途徑而實現［14］。在非小細胞肺癌中的研究也發現NRP-1能通過PI3K/AKT及VEGF途徑共同作用，影響肺癌的遠處轉移和復發水平［15］。Staton 等［3］研究報道了 NRP-1 表達與VEGF及腫瘤微血管生成的關系，在大腸癌組織中的NRP-1表達與MVD及VEGF呈正相關，且隨著腫瘤的發展、Dukes分期增加而升高。本研究顯示胃癌組織中NRP-1與VEGF的表達之間呈正相關，NRP-1、VEGF的表達與MVD呈正相關，MVD值隨NRP-1、VEGF表達程度增加而升高，表明NRP-1及VEGF的高表達促進了腫瘤微血管生成且與胃癌的進展密切相關，兩者的聯合檢測可在一定程度上判斷胃癌侵襲性及進展。

綜上所述，NRP-1的高表達與胃癌的進展有關，NRP-1可以增強VEGF的生物學作用，促進腫瘤的血管生成，提升胃癌的侵襲和轉移行為，因此可作為評價胃癌生物學行為的標志物之一。同時，NRP-1作為腫瘤抗血管治療的新靶點具有一定的臨床價值。本研究從腫瘤血管生成方面對NRP-1和VEGF與胃癌的關系進行了初步探討，今后還可從腫瘤免疫方面對NRP-1進行深入研究，更深層次揭示其作用機制。

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