喉鱗狀細(xì)胞癌RECK基因甲基化狀態(tài)與放療敏感性的關(guān)系

崔 靜 李 輝 盧琳琳

喉癌在人類惡性腫瘤中所占比例不足2%，但其發(fā)病率具有較大的區(qū)域性差異，好發(fā)于60～70歲，以男性高發(fā)，其病因目前尚不完全明確［1］。有研究［2］報(bào)道，過量的吸煙、飲酒、HPV感染等均為誘發(fā)喉癌的危險(xiǎn)因素。DNA異常甲基化是惡性腫瘤的早期事件，并可以作為某些腫瘤診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志。RECK（reversion-inducing cysteine rich protein with kazal motifs）是一種新型抑癌基因，具有抑制腫瘤細(xì)胞再生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的作用。有研究［3-4］表明，RECK基因表達(dá)下降與啟動(dòng)子區(qū)的甲基化有關(guān)。DNA甲基化是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的激活引起，其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的重要作用已引起人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注。此外，有研究［5］報(bào)道DNA錯(cuò)配修復(fù)失敗與體外培養(yǎng)的癌細(xì)胞株對(duì)放化療藥物的敏感性有重要關(guān)系，但其臨床相關(guān)性尚不明確。病理學(xué)上大多數(shù)喉癌是鱗狀細(xì)胞癌。及早識(shí)別放療后影響喉鱗狀細(xì)胞癌藥物敏感性的表觀遺傳變化，對(duì)制定個(gè)體化化療方案具有重要的臨床意義。本研究檢測(cè)了原發(fā)性喉鱗狀細(xì)胞癌組織和正常喉黏膜組織RECK基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)，探討RECK基因甲基化與放療敏感性及治療效果是否存在某種關(guān)聯(lián)，旨在為預(yù)測(cè)放療敏感、提示預(yù)后提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集

選取2006年7月至2007年12月在本院接受治療的喉鱗狀細(xì)胞癌患者為研究對(duì)象，在外科手術(shù)切除術(shù)前填寫知情同意書。所有標(biāo)本均經(jīng)手術(shù)切除并經(jīng)病理學(xué)檢查明確診斷，排除合并其他惡性腫瘤者及術(shù)前接受過抗腫瘤治療（化、放療等）者。最終70例患者納入本研究，其中男性52例，女性18例，年齡32～64歲，平均年齡（45.23±8.36）歲（排除年齡≥65歲患者），其他病理參數(shù)見表1。喉鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋，-70℃儲(chǔ)存。另隨機(jī)選取同期15例健康者的喉黏膜標(biāo)本為對(duì)照組。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器 蛋白酶K（北京艾比根生物技術(shù)有限公司），Tris-Base（上海拜沃生物科技有限公司），Wizard DNA Clean-Up System（美國(guó)Promega公司），Tap酶（美國(guó)Invitrogen公司），甲基化轉(zhuǎn)移酶（M.SssI）（美國(guó)NEB公司），引物、三氯甲烷、飽和酚、乙二胺四乙酸、十二烷基磺酸鈉、無(wú)水乙醇（大連寶生生物公司）。恒溫水浴箱（美國(guó)SHELLAB公司），高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），Gene Amp 9700型PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI公司），凝膠自動(dòng)成像儀（TOCAN 320型），電泳儀（美國(guó)伯樂公司）。

1.2.2 DNA提取 采用標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶K消化法進(jìn)行DNA提取，在提取之前，組織標(biāo)本經(jīng)蘇木精、伊紅染色腫瘤細(xì)胞，并選擇喉癌細(xì)胞≥75%區(qū)域的組織提取DNA。

1.2.3 亞硫酸氫鈉修飾 參照試劑盒說明進(jìn)行操作：先將約2 μg DNA在1.5 mL EP管中，用雙蒸水稀釋至50 μL，加5.5 μL新鮮配制的3M NaOH后42℃水浴30 min，然后加30 μL 10 mM對(duì)苯二酚至上述水浴后的混合液中；再加入520 μL 3.6M亞硫酸氫鈉，加200 μL石蠟油，50℃避光水浴16 h。

1.2.4 修飾后DNA純化回收 預(yù)熱樹脂10 min（37℃），將移液器槍頭伸入石蠟油層下吸取混合液600 μL于潔凈2 mL EP管中；然后使用Promega Wizard Clean up DNA純化回收系統(tǒng)，對(duì)修飾后的DNA進(jìn)行純化回收。

1.2.5 甲基化特異性PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)體系：去離子水11.65 μL；10×Buffer 2 μL；dNTP 1.6 μL；上、下游引物各1 μL；DNA模板3 μL；Tap酶0.15 μL；加去離子水至20 μL。循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min后35個(gè)循環(huán)：94℃變性30 s，54℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，最后1個(gè)循環(huán)延伸5 min。將產(chǎn)物瓊脂糖凝膠（2.5 g/L）電泳，GeneFinder染料染色。以甲基化酶處理、未處理的正常人外周血細(xì)胞、去離子水分別作為甲基化陽(yáng)性對(duì)照、甲基化陰性對(duì)照及空白對(duì)照。每批標(biāo)本同時(shí)擴(kuò)增甲基化和非甲基化陽(yáng)性對(duì)照。甲基化上游引物5'-GTTAGTTTTTTTTTTTATTTTAGTGGTTCG A-3'，下游引物 5'-TCCAAAACCTCCCGAAAACGAA AACG-3'；非甲基化上游引物5'-GGTTAGTTTTTTT TTTTATTTTAGTGGTTTGA-3'，下游引物 5'-ATTTCC AAAACCTCCCAAAAACAAAAACA-3'。

1.3 臨床資料

手術(shù)后所有患者均在本院放射科接受6個(gè)周期的放療，2 Gy/次，1次/d，5 d為1個(gè)周期，總劑量66～72 Gy。放療療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：完全緩解（CR）：影像學(xué)未發(fā)現(xiàn)腫瘤或腫瘤消失，癥狀、體征消失，維持≥4周，胸苷激酶或鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)抗原均在正常值范圍內(nèi)（胸苷激酶≤2 pmol/L，鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)抗原≤1.5 ng/mL）；部分緩解（PR）：影像學(xué)暫未發(fā)現(xiàn)腫瘤或腫瘤消失，癥狀、體征部分消失，維持＜4周，胸苷激酶及鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)抗原較原來增高20%～50%；穩(wěn)定（SD）：臨床癥狀、體征、血清學(xué)指標(biāo)未見明顯改變；進(jìn)展（PD）：影像學(xué)發(fā)現(xiàn)腫瘤，臨床癥狀、體征加重，胸苷激酶和鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)抗原較原來增高1倍以上。

患者在接受6個(gè)放療周期后結(jié)合上述標(biāo)準(zhǔn)，界定放療敏感與放療不敏感。CR、PR為放療敏感組，SD、PD為放療不敏感組。隨訪截至2013年1月，將完成5年隨訪的患者分為緩解組（CR、PR）和未緩解組（SD、PD）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理。RECK基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀況與臨床病理參數(shù)關(guān)系采用Pearson χ2檢驗(yàn)，必要時(shí)采用Fisher確切概率法分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床及病理學(xué)特征

70例患者中共37例（52.86%）發(fā)生RECK基因甲基化。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，RECK基因甲基化在不同年齡、性別、吸煙史、飲酒史等方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；但在有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM臨床分期及不同腫瘤分化程度間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅲ～Ⅳ期、低分化腫瘤患者RECK基因甲基化率分別高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅰ～Ⅱ期、中分化和高分化的患者（表1）。部分喉癌組織RECK基因甲基化特異性PCR電泳見圖1。

表1 70例喉鱗狀細(xì)胞癌患者病理參數(shù)RECK甲基化情況比較Table 1 Methylation status of RECK among different pathological parameters

2.2 RECK基因甲基化與放療敏感性的關(guān)系

經(jīng)6個(gè)周期放療后，47例（67.14%）患者對(duì)放療敏感，23例（32.86%）患者對(duì)放療不敏感。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，兩組RECK基因甲基化率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.095，P=0.014），放療敏感組RECK基因甲基化水平低于放療不敏感組（表2）。

2.3 RECK基因甲基化與治療效果的關(guān)系

本組患者共64例完成5年隨訪，其中緩解組45例，未緩解組19例。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，緩解組和未緩解組RECK基因甲基化率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.532，P=0.001），緩解組RECK基因甲基化水平低于未緩解組（表3），RECK基因甲基化可使腫瘤未緩解的危險(xiǎn)增高5.010倍（OR=5.010，95%CI：1.616～15.533）。

圖1 部分喉癌組織RECK基因甲基化特異性PCR電泳圖Figure 1 RECK methylation-specific PCR electrophoresis in part of laryngeal cancer tissues

表2 放療敏感組和放療不敏感組RECK基因甲基化率比較Table 2 RECK methylation rate between the groups with radiation-sensitivity and without

表3 緩解組和未緩解組RECK基因甲基化率比較Table 3 RECK methylation rate between remission and nonremission group

3 討論

RECK基因具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，其編碼的蛋白通過GPI錨定在細(xì)胞膜上，通過抑制金屬基質(zhì)蛋白酶達(dá)到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。在直腸癌及口腔鱗癌的研究中，甲基化RECK基因編碼的蛋白水平下降，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用下降。有研究［6］表明，甲基化水平會(huì)與放療療效呈一定相關(guān)性。關(guān)于喉癌的RECK基因甲基化狀態(tài)鮮見研究，本研究旨在揭示RECK基因甲基化狀態(tài)是否與喉鱗狀細(xì)胞癌的放療敏感性及療效有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CpG島甲基化過表達(dá)在喉鱗狀細(xì)胞癌中常見，正常喉黏膜組織均未見RECK基因甲基化，提示抑癌基因RECK甲基化可以作為惡性腫瘤早期發(fā)生的生物學(xué)標(biāo)志。另外，70例患者中47例（67.14%）患者對(duì)放療敏感，其中20例（42.55%）具有RECK甲基化；23例（32.86%）對(duì)放療不敏感，其中17例（79.31%）具有RECK甲基化，兩組的RECK基因甲基化率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示RECK基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與放療敏感性存在某種關(guān)聯(lián)，根據(jù)其甲基化狀態(tài)可以預(yù)測(cè)治療效果和預(yù)后。

近年來，抑癌基因的甲基化對(duì)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后的作用受到人們的關(guān)注。有研究［6-7］表明抑癌基因的失活引起表達(dá)下降，而對(duì)放療敏感的癌細(xì)胞株中，RECK基因表達(dá)高于放射不敏感組。本研究結(jié)果顯示，放療敏感組的RECK基因甲基化率低于放療不敏感組（P＜0.05），其機(jī)制可能是放射線刺激喉癌細(xì)胞中RECK基因表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞分化，達(dá)到放療的效果，這可能是放療敏感組預(yù)后較好的原因［8-10］；而RECK基因甲基化可以降低RECK基因的表達(dá)而無(wú)法發(fā)揮抑制腫瘤分化的作用，可能表現(xiàn)放療不敏感。目前，對(duì)于RECK基因與放療敏感性關(guān)系的研究較少，但是對(duì)于抑癌基因家族其他基因型的研究屢見報(bào)道。有研究［8］提示放射線可引起宮頸癌細(xì)胞p73基因高表達(dá)，在放射敏感細(xì)胞中p73基因的表達(dá)水平較放射不敏感的細(xì)胞高，與本研究結(jié)果一致。但這一結(jié)論目前尚存爭(zhēng)議。有研究［8］認(rèn)為，腫瘤組織中p73甲基化過表達(dá)通常提示預(yù)后較好；放療敏感的食管癌組織p73甲基化水平高于放療抗拒者。本研究認(rèn)為造成上述研究結(jié)果不一致的原因可能與研究的腫瘤類型有關(guān)［11-13］。

從臨床治療的角度而言，放療仍然是惡性腫瘤患者重要的治療措施，對(duì)放療的敏感與否直接關(guān)系到治療效果的優(yōu)劣［14］。但是，目前臨床上仍缺乏一種快速、有效、準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)患者放療敏感性方法，這是影響惡性腫瘤放療效果的一大重要原因［15］，本研究為解決這一問題提供了新的思路。本組結(jié)果提示，RECK基因甲基化水平與喉鱗狀細(xì)胞癌的放療敏感性和預(yù)后有關(guān)，對(duì)早期預(yù)測(cè)喉鱗狀細(xì)胞癌患者的放療敏感性，盡早制定個(gè)體化治療方案，對(duì)提高喉鱗狀細(xì)胞癌的抑制率和判斷其預(yù)后有重要意義。但抑癌基因甲基化水平是近年來開始研究的新型生物標(biāo)志物［16］，其潛在價(jià)值仍需大量的大樣本研究進(jìn)一步證實(shí)，同時(shí)需在臨床實(shí)踐中加以驗(yàn)證。

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