EZH2和Ki-67蛋白在腺樣囊性癌中的表達及其臨床意義

褚金曼 杜詠梅 駱樹瑜 李 蕊 董 瑞

涎腺腺樣囊性癌（salivary adnoid cystic carcinoma，SACC）是常見的惡性涎腺腫瘤之一。SACC的發生不僅涉及到癌基因、抑癌基因、DNA損傷修復基因等多種基因本身的突變，還涉及到DNA甲基化和組蛋白修飾等表觀遺傳學的改變，與異常的表觀遺傳調控相關［1］。EZH2（enhancer of zeste homolog2）是表觀遺傳調控因子PcG（polycomb group）蛋白核心成分［2］，是具有組蛋白甲基轉移酶活性的癌相關蛋白，與腫瘤的發展進程密切相關，因而近年受到廣泛關注。本課題通過研究EZH2蛋白和增殖指標Ki-67蛋白在腺樣囊性癌組織中的表達，探討EZH2與SACC臨床病理特征之間的關系以及EZH2與SACC增殖水平之間的關系，從而進一步了解EZH2在SACC進展過程中的調節機制，為腫瘤的創新性治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取天津醫科大學口腔醫院1983年2月至2013年2月正常腺體組織5例，腺樣囊性癌存檔蠟塊42例，男性17例，女性25例，年齡22～75歲，平均年齡47.29歲。根據WHO（2005）關于SACC的病理分類標準，篩狀型18例，管狀型10例，實體型14例。其中年齡＜50歲31例，＞50歲11例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期10例，Ⅲ～Ⅳ期32例。

1.2 方法

1.2.1 標本處理 所有標本均經10%中性福爾馬林緩沖溶液固定后，常規脫水、透明、石蠟包埋，5 μm連續石蠟切片，切片貼于經多聚賴氨酸處理的載玻片上，80℃烘片，行免疫組織化學染色。

1.2.2 主要試劑 即用型兔抗人EZH2多克隆抗體、即用型兔抗人Ki-67多克隆抗體（北京中山生物技術有限公司），SP通用型免疫組織化學試劑盒，DAB顯色試劑盒（北京中山生物技術有限公司）。

1.2.3 免疫組織化學 采用SP免疫組織化學染色法檢測EZH2蛋白和Ki-67蛋白的表達，按照試劑盒說明書嚴格操作，用PBS代替一抗做陰性對照。脫蠟至水，已知陽性乳腺癌組織作為EZH2、Ki-67的陽性對照組。微波抗原修復，阻斷內源性過氧化物酶，滴加一抗4℃過夜，二抗孵育，DAB顯色、復染、脫水、透明、封片。

1.2.4 結果判定 EZH2和Ki-67均主要表達在細胞核，用雙盲法觀察染色結果，半定量積分法分析結果，每例隨機觀察5個高倍視野（×400），每高倍視野計數100個瘤細胞。染色強度評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；再按陽性細胞所占的百分比評分：陰性為0分，陽性細胞＜25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，＞75%為4分。總體評分值=陽性細胞比例評分×染色強度評分，總分≤3分為陰性（-），3～6分為陽性（+），＞6分為強陽性（++）。

1.3 統計學方法

采用SPSS 16.0進行統計學處理，樣本陽性率采用χ2檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 EZH2蛋白的表達與臨床病理特征的關系

在腺樣囊性癌組織中EZH2蛋白的表達主要位于細胞胞核，呈黃色或棕黃色的顆粒沉淀（圖1）。統計結果顯示，EZH2蛋白在腺樣囊性癌組織中的陽性率為66.67%（28/42），5例正常涎腺組織中僅有1例的細胞胞核表達EZH2，其陽性范圍≤10%，根據結果判斷標準為陰性。兩者比較差異有統計學意義（χ2=5.71，P＜0.05）。在腺樣囊性癌組織中，EZH2在SACC實體型的表達水平高于篩狀/管狀型（P＜0.05），TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期患者EZH2蛋白的陽性率高于Ⅰ～Ⅱ期患者（P＜0.05）。不同患者性別、年齡、發病部位間差異無統計學意義（P＞0.05，表1）。

2.2 Ki-67蛋白表達與臨床病理特征的關系

在腺樣囊性癌組織中Ki-67蛋白的表達也主要位于癌細胞胞核，呈黃色或棕黃色顆粒（圖2）。統計結果顯示，Ki-67蛋白在腺樣囊性癌組織中的陽性率為78.57%（33/42），5例正常涎腺組織中未見表達，兩者差異有統計學意義（χ2=9.70，P＜0.05）。在腺樣囊性癌組織中，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期患者Ki-67蛋白的陽性率高于Ⅰ～Ⅱ期患者，兩者差異有統計學意義（P＜0.05）。Ki-67在SACC實體型的表達水平高于篩狀/管狀型（P＜0.05）。不同患者性別、年齡、發病部位間差異無統計學意義（P＞0.05，表2）。

2.3 EZH2和Ki-67蛋白表達水平的關系

在Ki-67陽性的33例腺樣囊性癌患者中，25例E2H2表達陽性，表達率75.76%（25/33），Ki-67陽性表達的9例中，3例EZH2表達陽性，表達率33.33%（3/9），兩者比較有統計學意義（P＜0.05）。EZH2和Ki-67蛋白在SACC中的表達趨勢一致：在實體型中EZH2和Ki-67兩種蛋白的表達水平均升高，在篩狀/管狀型中EZH2和Ki-67陽性細胞的范圍均較小。

圖1 EZH2在腺樣囊性癌中呈陽性表達 （SP×400）Figure 1 Positive expression of EZH2 in SACC （SP×400）

表1 腺樣囊性癌組織中EZH2表達與臨床病理特征的關系Table 1 Correlation between EZH2 expression and clinicopathological characteristics of salivary adenoid cystic carcinoma tissue

圖2 Ki-67在腺樣囊性癌中呈陽性表達 （SP×400）Figure 2 Positive expression of Ki-67 in SACC （SP×400）

表2 腺樣囊性癌組織中Ki-67表達與臨床病理特征的關系Table 2 Correlation between Ki-67 expression and clinicopathological characteristics of salivary adenoid cystic carcinoma tissue

3 討論

SACC是最常見的唾液腺惡性腫瘤之一，多見于中老年人，以腮腺和硬腭部多見。生長緩慢，但生存率低。Kokemueller等［3］報道74例腺樣囊性癌患者經手術切除及局部放射治療后，其總體5年生存率為71%，而10年生存率和15年生存率則分別為54%和37%。SACC的發生、發展是各種原因使原癌基因激活、抑癌基因失活，從而使細胞增殖和凋亡失調所致。近年發現，表觀遺傳變異在腫瘤的發生、發展和轉移中發揮重要作用，其作用形式主要包括調節細胞周期和阻斷下游基因。表觀遺傳（Epigenetics）是指通過多種形式對穩定的DNA序列或蛋白進行修飾，從而使基因表達發生了可遺傳的改變。這種改變能夠穩定保留，但也能夠在細胞增殖過程中和環境因素影響下迅速轉變。因此得出腫瘤細胞基因組的表觀遺傳修飾與穩定的基因組DNA序列相比更具有靈活性，對疾病的影響作用不容置疑［4］。

EZH2是多聚梳群（polycomb group，PcG）基因家族重要成員之一，同時也是重要的表觀遺傳修飾酶，通過甲基化核小體組蛋白H3的27位賴氨酸殘基，使下游基因沉默。這些下游靶基因大部分具有抑制腫瘤發生的作用，它們的沉默將解除對腫瘤發生的抑制，導致腫瘤形成。除此之外，EZH2還介導參與細胞周期調控、細胞衰老和細胞分化［5］。有研究［6］報道，在卵巢癌組織中，EZH2的高表達與其組織學分級及疾病晚期存在明顯相關性，并進一步指出EZH2可以通過調控轉化生長因子β（TGF-β1）的表達影響細胞的遷徙和侵襲能力。Lu等［7］研究發現，EZH2不僅在卵巢癌組織及癌細胞中高表達，相對正常內皮細胞，其在腫瘤相關內皮細胞中亦呈現高表達。并進一步發現，在腫瘤相關內皮細胞中血管內皮生長因子（VEGF）直接調控EZH2的表達，EZH2再通過抑制強抗血管生成因子（vasohibin1，VASH1）的活化參與腫瘤血管的發生。人類乳頭瘤病毒（HPV）陽性的宮頸癌細胞通過HPV16 E7活化轉錄水平的EZH2基因表達而參與其細胞周期的調控，并且通過誘發G1～S期細胞進入分裂期來促進癌細胞增殖［8］。有學者發現EZH2在胃癌中的表達水平高于正常組織，認為EZH2基因可以促進胃癌的發生發展［9］。Ki-67是一種細胞增殖核抗原，位于第10號染色體，其蛋白的表達具有細胞周期特異性：G1中晚期開始表達，S期、G2期逐漸增加，在M期達到高峰，M后期逐漸降解或丟失抗原決定簇，在G0期細胞沒有表達。因此能有效的反應細胞增殖狀態，目前已被廣泛應用于研究、評估腫瘤的增殖活性及生物學行為。研究表明與正常卵巢表面上皮相比，在原發性卵巢上皮性癌中EZH2明顯高表達，并且其表達與增殖指標Ki-67顯著相關［10］。Bondgaard等［11］通過研究EZH2與Ki-67在96例肺神經內分泌腫瘤中的表達發現二者具有顯著相關性（P＜0.001），并且表達水平存在一致性，表明EZH2預示著高度增殖。曹相玫等［12］通過檢測EZH2與Ki-67蛋白在不同分化級別的原發性肝癌組織中的表達水平發現兩者的表達趨勢一致，并且在低分化原發性肝癌中EZH2的表達水平明顯高于Ki-67，提示EZH2能更為敏感的反應細胞增殖，為臨床診斷提供了更為敏感的指標。但EZH2蛋白表達與腺樣囊性癌的臨床病理特征和增殖狀態是否相關，目前鮮見報道。

本研究結果顯示，SACC的實體型和篩狀/管狀型組織的EZH2蛋白陽性表達率分別是92.86%（13/14）、53.57%（15/28），兩者之間的差異有統計學意義（χ2=4.83，P＜0.05），EZH2蛋白在實體型中的表達明顯高于篩狀/管狀型中的表達，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期患者的EZH2蛋白的陽性率高于Ⅰ～Ⅱ期患者（P＜0.05），因此認為EZH2的表達水平與SACC的組織學類型及臨床分期相關。Vékony等［13］研究分析得出與篩狀和管型相比，EZH2表達水平更高的實體型ACC患者生存率更低。本研究應用Ki-67作為觀察細胞增殖的輔助指標，分析EZH2與SACC細胞增殖能力的關系。結果顯示，SACC的實體型和篩狀/管狀型組織的Ki-67蛋白陽性表達率分別是100.00%（14/14）、67.86%（19/28），兩者之間的差異有統計學意義（χ2=3.97，P＜0.05），Ki-67蛋白在實體型中的表達明顯高于篩狀/管狀型中的表達，即Ki-67的表達水平與SACC的組織學類型相關。該結果還提示Ki-67與EZH2蛋白在SACC中的表達趨勢相一致。部分學者通過Ki-67的表達來評估EZH2與腫瘤細胞增殖之間的關系，發現二者具有顯著相關性［14］。并且有研究［15］顯示，在卵巢癌細胞株OVCAR-3中，siRNA介導的EZH2表達下調，可使OVCAR-3的增殖能力明顯下降，提示EZH2基因可以調節卵巢癌細胞的增殖。以上結果表明EZH2蛋白在細胞周期管理中起作用，進一步推斷EZH2的表達水平能夠反映細胞的增殖狀態。在相對較大樣本含量中，EZH2在33例低分化腫瘤中的表達率明顯高于67例高分化腫瘤（P＜0.000 1），并且EZH2與Ki-67之間具有顯著相關性（P＜0.001）［11］。另外，為了更客觀的體現在低分化和高分化腫瘤中EZH2和Ki-67表達之間的相關性，本研究將在后期的實驗中增加樣本數量進行綜合評價。

綜上所述，EZH2能夠成為提示SACC臨床分期、病理分型及增殖能力的分子標志物，對臨床診斷具有一定的參考價值。

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